血管内皮细胞生长因子启动子突变体萤光素酶报告基因载体的构建

张述 ，刘婕 ，刘世翠 ，林娅红 ，3，张亚楠 ，丁丽华 ，叶棋浓

1.厦门长庚医院，福建 厦门 361028；2.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100850；3.福建农林大学 生命科学学院，福建 福州 350002

肿瘤的生长扩增以及向远处的转移都与肿瘤血管的生成密切相关，如果缺乏毛细血管，移植瘤体的直径将被限制在0.4 mm左右，肿瘤细胞容易发生坏死或凋亡，控制肿瘤的血管生成可以有效限制肿瘤的生长及侵袭[1]。在肿瘤发展相对较早的阶段即开始有血管生成，肿瘤血管的增加与肿瘤的生长、血行转移及不良预后有着密切的关系[2-3]。肿瘤细胞分泌的许多细胞因子都可以刺激血管生成。在现已发现的促血管生成因子中，血管内皮细胞生长因子（vas⁃cular endothelial growth factor，VEGF）是最重要的血管生成调节因子，在多种血管生成中起核心调控作用。VEGF在多种肿瘤的生长、侵袭及转移的多个过程中都发挥着重要作用。VEGF家族有多个成员，其中VEGF-A分布范围较广，且作用较大。VEGF-A基因位于染色体6p21.3，全长28 kb，编码VEGF-A的基因序列约14 kb，启动子区域约为2400 bp，该启动子上含有多个转录反应元件。对VEGF转录具有调控作用的转录因子很多，包括激活蛋白 1（activator protein-1，AP-1）、缺氧诱导因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）等。HIF-1 是介导肿瘤缺氧适应的关键转录调控因子，在缺氧环境中表达增加，可使肿瘤细胞耐受缺氧，促进肿瘤生长、浸润转移[4-5]。HIF-1是异源二聚体蛋白，由亚基HIF-1α和 HIF-1β组成[6]。HIF-1α的表达与细胞的氧气浓度相关，在多种肿瘤中，HIF-1α在缺氧条件下转录激活VEGF。

VEGF的表达调控主要是在转录水平，因此，对VEGF表达的转录因子进行深入研究有重要意义。我们构建了含VEGF启动子不同片段的萤光素酶报告基因载体，检测了不同片段报告基因与转录因子的结合情况，发现VEGF启动子的-1128～-728区域可以与HIF-1α结合，并促进VEGF启动子的转录活性。用构建的报告基因载体可筛选新的调控VEGF启动子活性的转录因子，为研究这些调节因子在肿瘤中的作用，寻找治疗肿瘤的新靶点奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

人胚胎肾细胞293T由本实验室保存，用含10%小牛血清的DMEM培养基于含5%CO2的孵箱内37℃常规培养；大肠杆菌 DH5α为本实验室保存；pGL4-basic载体、质粒提取试剂盒购自Promega公司；含人全长VEGF启动子序列的表达载体、HIF-1α真核表达载体由本实验室保存；LA-Taq酶、dNTP、限制性内切酶、T4DNA连接酶购自TaKaRa公司；DMEM培养基、LipofectAMINE2000转染试剂购自Invitrogen公司；DNA序列分析由奥科公司完成。

1.2 VEGF启动子的PCR扩增

根据GenBank中的VEGF启动子序列（登录号为AF095785），以VEGF启动子全长为模板，PCR扩增VEGF启动子的5'端系列缺失突变体。引物及序列见表1，由北京赛百盛基因技术有限公司合成。

1.3 重组质粒的构建

上述PCR产物用XhoⅠ、HindⅢ双酶切后连接到经同样酶切处理的pGL4-basic载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒，将PCR鉴定和酶切鉴定阳性的质粒进行序列分析。

表1 引物及序列

1.4 质粒瞬时转染293T细胞

将293T细胞用DMEM培养基（含10%小牛血清）转种到24孔板，在37℃、5%CO2条件下培养，24～36 h后转染，分别将质粒 DNA 和 1.6 μL Lipo⁃fectAMINE2000溶于50 mL不含血清、抗生素的DMEM培养基中，之后将二者混合，室温放置20 min后加到24孔细胞板中。

1.5 萤光素酶和α-半乳糖苷酶活性测定

萤光素酶活性测定基本按照Promega公司试剂说明书进行。细胞转染24 h后弃培养基，用PBS洗1次，在24孔板中每孔加入80 μL裂解缓冲液，室温轻摇15 min，将细胞裂解物收集到1.5 mL离心管中，持续振荡5 min，4℃、12 000 r/min离心5 min，收集上清，取10 μL加到25 μL萤光素酶底物中，立即用荧光计测定萤荧光素酶活性。

用ONPG测定α-半乳糖苷酶活性。取上述上清10 μL 与 90 μL Z 缓冲 液/β-巯 基 乙 醇 溶 液（10 mL 16.1 g/L Na2HPO4·H2O，0.75 g/L KCl，0.246 g/L MgSO4·7H2O，27 μL β-巯基乙醇）混合，加入 20 μL 4 mg/mL ONPG，常温放置，当出现浅黄色时加入50 μL 1 mol/L Na2CO3溶液终止反应，测定样品的D420nm值。

1.6 Western印迹

转染后收集细胞，加入SDS加样缓冲液，煮沸10 min，离心后取上清液进行SDS-PAGE，电转移至硝酸纤维素膜，用5%脱脂奶粉于4℃封闭1 h，加入用5%脱脂奶粉1∶5000稀释的Myc抗体或1∶10 000稀释的GAPDH抗体，加入用5%脱脂奶粉稀释的辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG，室温轻摇1 h，TBST洗膜3次，每次7 min，用化学发光法显色5 min，压片显影。

1.7 不同片段VEGF启动子报告基因载体活性测定

分 别 将 0.2 μg 质 粒 pGL4-VEGF400、pGL4-VEGF800、 pGL4-VEGF1200、 pGL4-VEGF1597、pGL4-VEGF1982、pGL4-VEGF2377、pGL4-VEGF、pGL4-basic与0.1 μg表达α-半乳糖苷酶的质粒和50 ng空载体XL-5或50 ng HIF-1α质粒共同瞬时转染293T细胞，24 h后收集细胞，测定萤光素酶和α-半乳糖苷酶活性，其中α-半乳糖苷酶活性用于校正细胞转染效率。启动子活性为细胞转染效率校正后的萤光素酶活性。

2 结果

2.1 VEGF启动子的PCR扩增

以VEGF启动子全长为模板，PCR扩增VEGF启动子的5'端系列缺失突变体，长度分别为2377、1982、1597、1200、800、400 bp，DNA 凝胶电泳结果表明与预期大小相符（图1）。

2.2 VEGF启动子报告基因载体的构建

将上述PCR产物用XhoⅠ、HindⅢ双酶切，克隆到经同样双酶切处理的pGL4-basic载体中，抗性筛选得到的重组质粒经PCR鉴定为阳性（结果未示）。酶切鉴定结果进一步表明，该重组质粒有与预期大小相似的插入片段，而空载体中无插入片段（图2）。DNA序列分析结果证实该插入片段为VEGF启动子（结果未示）。

2.3 确定VEGF启动子与HIF-1α相互作用的最主要的转录调控区域

对照组空载体XL-5、5'端缺失突变体报告基因载体及VEGF全长启动子转染293T细胞后，检测报告基因的转录活性，发现VEGF启动子本身具有转录活性；转染HIF-1α后，-328～+72、-728～+72 bp区域启动子转录活性没有明显升高，而-1128～+72 bp区域启动子转录活性在结合HIF-1α后由182增至385，约升高了2.1倍（P＜0.05）。因此，HIF-1α可能结合在-728～-1128 bp区域（图3）。通过序列分析，我们发现VEGF启动子-728～-1128 bp区域存在HIF-1α 结 合 序 列 HRE（HIF-1 response element，TACGTGGG），这与我们的结果是一致的。Western印迹表明，带Myc标签的HIF-1α真核表达载体成功表达（图4）。因此，-1128～+72 bp区域启动子与HIF-1α表达载体共转染活性升高是由于启动子和HIF-1α相互作用引起的。

图1 VEGF启动子不同片段的PCR扩增

图2 pGL3-VEGF不同片段的XhoⅠ和HindⅢ酶切鉴定图

3 讨论

VEGF在肿瘤血管生成中起核心作用，因此，抗VEGF信号通路治疗成为研究热点[7-8]。通过阻断VEGF及其受体导致的血管通透性的增加，可抑制肿瘤的生长。VEGF的表达调控主要发生在转录水平，因此，通过转录因子对VEGF的转录进行调控是最主要的途径。转录因子不仅可直接结合在VEGF的启动子上促进VEGF的转录，而且可通过与生长因子、癌基因和抑癌基因的相互作用发挥调控VEGF表达的功能。因此，对VEGF表达的转录因子进行深入研究，有助于阐明肿瘤发生、发展和转移机理，确立诊断和预后指标，以及开发有效的肿瘤治疗药物。

我们所克隆的VEGF-A启动子全长序列是细胞中天然存在的。VEGF全长启动子及5'端缺失突变体报告基因分析表明，VEGF启动子-328～+72 bp区具有最高的转录活性，这与已报道的结果一致；-328～+72 bp区域是VEGF转录因子Sp1、AP2、Egr-1等的结合位点。应用VEGF全长启动子及5'端缺失突变体报告基因与HIF-1α共转染，发现HIF-1α结合在VEGF启动子-718～-1128 bp区域，通过序列分析，我们发现此区域存在HRE序列[9-10]。VEGF全长启动子及5'端缺失突变体报告基因载体的构建，为进行转录活性测定实验、研究其他转录因子与VEGF启动子的相互作用及其相互作用的区域、筛选新的针对肿瘤血管生成相关的治疗靶点奠定了良好的基础。

图3 VEGF启动子不同片段与HIF-1α相互作用的转录活性测定

图4 Western印迹鉴定HIF-1α在293T细胞中的表达

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