活血通经消瘀巴布剂组方药物木芙蓉叶等乙醇提取工艺研究

杨一丁 张 伟 杨文婷 高文勇

(1青岛市市立医院，青岛，266071;2青岛市海慈医疗集团，青岛，266033;3山东中医药大学药学院，济南，250355;4青岛四方嘉兴路街道人民路社区卫生服务站，青岛，266033)

我们在本实验以醇浸物和大黄素为指标，对活血通经消瘀巴布剂组方药物中的木芙蓉、紫草和大黄进行乙醇提取工艺正交设计优化实验研究，考察乙醇浓度，乙醇用量(倍)，提取时间(h)，提取次数等因素，确定最佳工艺条件。

1 仪器、试剂与药材

1.1 仪器 Agilent 1100型高效液相色谱仪二元泵DAD检测器(美国);JA2003型电子分析天平(上海);超声波清洗器:KQ100型(昆山市超声波仪器厂)工作频率40 kHz，输出超声电功率100 W;BuchiR215V型旋转蒸发仪(瑞士)。

1.2 试剂 大黄素对照品(中国药品生物制品检定所，批号:0756－00110);甲醇为色谱纯(美国天地试剂公司)，乙醇为药用，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

1.3 药材 药材购自安徽亳州，经青岛市药检所吴爱英主任中药师鉴定，木芙蓉叶为锦葵科植物木芙蓉Hibiscus mutabilis L.的叶，大黄为Rheum officinale Baill.的干燥根及根茎，紫草为紫草科植物新疆紫草Arnebia euchroma(Royle)Johnst的干燥根。

2 实验方法

2.1 醇浸物测定方法 量取醇提液10 mL，精密称重，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称重。计算醇浸物含量［(g/g)×%］。

2.2 大黄素含量测定方法［1］

2.2.1 色谱条件 色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6 mm × 250 mm，5 μm，Lichrospher，汉邦科技)，流动相为甲醇－0.1%磷酸溶液(85∶15)，流速1.0 mL/min;检测波长为254 nm。理论塔板数按大黄素峰计算应不低于1500。

2.2.2 标准曲线的绘制 精密称取大黄素对照品1.408 2 mg，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取1 mL置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制得浓度为5.638 2 μg/mL的大黄素对照品溶液。分别精密吸取大黄素对照品溶液 1.0、2.0、4.0、6.0、10.0、15.0μL，按2.1.1色谱条件测定峰面积积分值，以峰面积积分值为纵坐标、大黄素量为横坐标，结果在选定的色谱条件下，大黄素含量在0.005 6～0.084 μg的范围内均呈现良好的线性关系;回归方程为y=361658x－368，r=0.999 5。

2.3 正交方案设计 以醇浸膏和大黄素提取率为指标，以乙醇浓度，乙醇用量(倍)，提取时间(h)，提取次数为因素，进行L9(34)的正交试验。正交因素和水平见表1。

表1 L9(34)正交试验因素和水平表

2.4 乙醇提取实验 将木芙蓉叶、紫草和大黄等3味药药材细粉(过40目筛)，按处方比例量分别称取9份，每份100 g，分别按L9(34)表中给出的条件进行提取，提取时间从沸腾开始时记录。提取结束后，分别合并提取液，旋转蒸发回收乙醇至适量，再以无水乙醇定容至100.00 mL，得1－9号样品液。

3 正交试验结果

1)分别精密量取“2.4乙醇提取实验”制得的1－9号样品溶液各10 mL，按“2.1醇浸物测定方法”分别测定并计算1－9号样品醇浸物含量(mg/g)。每个样品重复测定3次，计算3次平均值。结果见表2。2)将1)步制得的其中1份1－9号醇浸物分别加8%的盐酸10.00 mL溶解，超声处理2 min，再加三氯甲烷10 mL，加热回流1h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，减压回收三氯甲烷至干，残渣用甲醇溶解、转移并定容至10 mL，摇匀，滤过。取续滤液，按“2.2大黄素含量测定方法”分别进样、测定，计算1－9号样品大黄素含量(mg/g%)。每个样品重复测定3次，计算3次平均值。结果见表2。

表2 正交试验表及结果(n=3)

表3 醇浸物方差数据分析(n=3)

4 结果分析

以醇浸物提取率为指标，影响因素从大到小依次为D＞A＞C＞B;其中A因素和D因素有统计学意义(P＜0.05)，B因素和C因素无显著影响;最佳条件为A2B1C1D3。以大黄素提取率为指标，影响因素从大到小依次为D＞A＞C＞B，其中A因素和D因素有非常显著影响(P＜0.01)，C因素有显著影响(P＜0.05)，B因素无显著影响;最佳条件为A2B2C1D3。综合醇浸物和大黄素提取率，考虑到B因素对这两种指标成分提取率均无显著影响，选择A2B1C1D3方案进行工艺验证实验，结果该方案两种指标成分提取率分别醇浸物为 2.4208［(g/g)×%］，大黄素为 241.22［(mg/g×%］。因此确定A2B1C1D3为最终生产工艺条件，即用浓度为60%的乙醇，提取3次，每次乙醇用量为药材重量的6倍，每次提取时间为40min。

表4 大黄素方差数据分析(n=3)

5 工艺说明

5.1 关于提取方案 该巴布剂组方药物中的木芙蓉、紫草和大黄，及提取挥发油后的乳香、没药、三棱、莪术等药药渣均含有醇溶性成分。木芙蓉主要化学成分为黄酮苷、酚类、氨基酸、鞣质、还原糖、甾类化合物和挥发油类成分，其中黄酮苷是其主要活性成分［2－3］，具有抗炎镇痛等药理作用［4］。姚莉韵［5］实验研究认为乙醇回流提取总黄酮效果大大高于水煎法、温浸法，回流提取的最佳工艺条件是用12倍量70%乙醇提取3次，每次3h，其中乙醇浓度是影响提取率的主要因素。大黄主要含蒽醌类化合物，总量为1.01% ～5.19%［6］。蒋孟良等［7］比较几种提取方法对总蒽醌提取影响，结果认为醇提＞渗漉＞水提，热提强于冷提。朱雪瑜等［8］研究认为60% ～80%乙醇浓度对大黄总蒽醌(游离蒽醌和结合蒽醌)有较好的提取效果，最佳工艺为用70%的乙醇提取3次，每次1 h，溶剂量为药材的10、8、8倍。紫草主要生物活性成分为萘醌类等多种化合物［9－10］，乙醇浓度对萘醌收率有显著影响［11］。因此，实验设计以乙醇为溶媒进行正交设计优化实验，确定最佳工艺条件。

图1 高效液相色谱图

5.2 关于大黄素含量测定方法 参考含大黄复方制剂大黄素含量测定的有关报道资料，先后对流动相甲醇 －0.1% 磷酸(80∶20)［12－13］、甲醇 － 0.1% 磷酸(85∶15)［14］、甲醇 － 0.2% 磷酸(84∶16)［15］、甲醇 － 0.2%磷酸(70∶30)［16］、乙腈 － 甲醇 － 1% 磷酸(35∶37∶28)［17］、甲醇 － 水 － 冰醋酸(72∶28∶1.0)［18］等系统进行了预试验，观察系统分离效果。结果表明，用甲醇－0.1%磷酸溶液(85∶15)作为流动相测定样品中大黄素含量较为适宜，出峰时间短，阴性对照品无干扰(见图1)。确定大黄素含量测定的色谱条件。

5.3 关于精密度和重复性 对照品溶液连续进样5次大黄素峰面积的RSD为1.48%，2号乙醇提取液按“3.2”步处理后依次进样5次大黄素峰面积积分值的RSD值为1.19%，表明该色谱条件的精密度和重复性良好。

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