蒽醌-2-磺酸钠探针快速测定牛奶中三聚氰胺方法的研究

贝峰 刘存芳

蒽醌-2-磺酸钠探针快速测定牛奶中三聚氰胺方法的研究

贝峰 刘存芳

（泰安出入境检验检疫局 山东 泰安 271000） （山东银宝食品有限公司）

为快速检测牛奶中三聚氰胺含量，基于三聚氰胺(MA)和蒽醌-2-磺酸钠（AQ）分子探针结合后电流的降低值与三聚氰胺含量成线性的原理, 建立了以蒽醌-2-磺酸钠(AQ)为分子探针检测牛奶中三聚氰胺含量的方法。该方法的最低检出限可以达到5.00×10-9M(0.6μg/ml)，整个检测过程可以在30min内完成。

蒽醌-2-磺酸钠 探针 牛奶 三聚氰胺

食品安全一直是人们关心的话题，2008年三聚氰胺(MA)事件的爆发，使人们对牛奶中MA的关注推向了高峰。MA是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，有一定的肾毒性，由于其含氮量约为66％，远高于平均含氮量为16%的蛋白质，因此常被非法用作食品或饲料添加剂，以期提高食品检测中的蛋白质指标(以凯氏定氮法测定)。目前牛奶中MA检测的方法主要有气相色谱-质谱法[1]、高效液相色谱法[2,3]、液相色谱-质谱法[4]等，这些方法需要昂贵的大型仪器、专业的分析人员和复杂的预处理，难以实现对牛奶的实时、快速检测。

本研究采用AQ为分子探针，利用AQ与MA结合后引起的电化学响应信号的变化，建立了以AQ为电活性探针间接测定牛奶中无电活性MA的新方法。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

CHI660电化学工作站(上海辰华)，三极体系:玻碳(GCE)电极为工作电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极, 铂丝电极为对电极，上海辰华。三聚氰胺标准品(MA)：99.7%，蒽醌-2-磺酸钠(AQ)，氧化铝(200-300目)：用前在研钵内研磨、过筛；实验用水均为二次蒸馏水。

1.2 试验方法

1.2.1 玻碳电极的制备 玻碳电极分别用0.3μm、0.05μm Al2O3抛光,再分别在重蒸馏水及无水乙醇中各超声清洗5min，洗净晾干备用。

1.2.2 MA测定体系的建立 以玻碳(GCE)电极为工作电极, 饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，铂丝电极为对电极，建立三电极系统，以0.1mol/L的PBS(pH＝4)配制不同浓度的AQ和MA溶液，反应3min，CHI660电化学工作站以示差脉冲伏安法(DPV)测氧化电流。

1.2.3 牛奶样品中MA的检测 移取4.0ml牛奶，加入1.2ml的300g/L的三氯乙酸溶液，涡流混合1min，以3500r/ min离心5min，上清液转移到另一离心管中，用磷酸溶液调pH至4.0，静置1min，再以3500r/min离心3min，取出上清液，加入浓度为1×10-4mol/L的AQ，混匀，3min后用示差脉冲伏安法测氧化电流，根据标准曲线可以得出样品中的MA浓度值。

2 结果与讨论

2.1 QA、MA在GCE上的循环伏安图

以AQ为电化学探针，测定AQ在0.1mol/L PBS中的电化学行为，结果见图1，pH=4时，AQ在-0.3~-0.4V之间有一对明显的准可逆氧化还原峰，而MA基本上没有峰。加入MA后，AQ的氧化还原电位基本不变，峰电流显著降低，表明AQ与MA结合后，AQ在玻碳电极上的反应受到抑制。

图1 AQ与MA的循环伏安图

（AQ与MA浓度分别为1×10-4mol/L, 5×10-5mol/L；a到c分别为AQ、AQ+MA、MA）

2.2 AQ与MA的反应时间

MA与AQ混合，MA的氨基迅速与AQ上的磺酸基结合形成氢键，抑制了AQ的氧化还原反应，使峰电流减小。试验结果显示，AQ与MA混合后0.5min，峰电流迅速减小，之后电流减小的速度逐渐变慢，3min后峰电流基本不变，因此，试验选用的反应时间为3min。

2.3 反应体系pH

采用DPV法测定不同pH的PBS反应体系中AQ以及AQ与MA结合后的峰电流，由图2可知，pH=3、4、5时，AQ的氧化还原峰电流较大，峰形较好；pH=6、7、8时，AQ的氧化还原峰电流变化不大，且峰形逐渐变得不规则，表明反应在酸性条件下灵敏度较高。由图3可知，pH＝4时，不仅AQ的峰电流最大，而且加入MA后，峰电流减小也最明显。因此实验选用pH＝4作为实验条件。

图2 不同pH下的循环伏安图

(a-f pH分别为3、4、5、6、7、8 ；AQ与MA浓度分别为1×10-4mol/L, 5×10-5mol/L)

图3 不同PH下峰电流变化示意图

2.4 MA线性范围

固定AQ浓度为1×10-4mol/L，逐渐增加MA的浓度，AQ的氧化峰电流逐渐减小(图4)。氧化峰电流的减小值与加入的MA之间的关系呈抛物线形(图5)，符合类Langmuir吸附，其线性关系见图5内插图。

图4 不同MA浓度时AQ与MA混合后的循环伏安图

(AQ浓度为1×10-4mol/L, a-f MA的浓度分别0、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-5、1×10-4mol/L)

2.5 牛奶样品的测定

取25.0mL空白牛奶样品，分别添加不同浓度水平MA溶液，涡流混合2min，放置1h，按照1.2.3的要求进行处理，3min后用示差脉冲伏安法测氧化电流，根据标准曲线计算MA浓度值。试验结果见附表，说明该方法比较灵敏可靠。

图5 电流降低值与MA浓度之间的关系

内插图：线性方程：y = 6.0314+1.0574x 相关系数：R= 0.9851

（内插图为AQ浓度为1×10-4mol/L时, 氧化峰电流降低值与MA浓度之间的线性关系图）

附表 牛奶样品的检测结果

添加浓度(M)5.00×10-95.00×10-85.00×10-75.00×10-65.00×10-5 测量结果平均值(M)5.06×10-95.01×10-85.05×10-75.05×10-65.04×10-5 变异系数(%)5.424.522.012.991.14

3 结论

本研究建立出一种以AQ为探针快速、灵敏的检测牛奶中MA的电化学分析方法，该方法操作简便、快捷、灵敏度高，整个过程可在30min内完成，方法的最低检出限可以达到5.00×10-9，可应用于原料收购、生产过程以及出口检验检疫的现场实时筛选检测。

[1] 王征. GC-MS法测定动物食品中的三聚氰胺[J]. 福建分析测试, 2008, 17(2): 1-4.

[2] 王浩, 刘艳琴. 固相萃取与高效液相色谱联用测定宠物食品中三聚氰胺[J]. 分析化学, 2008,36(2): 273-275.

[3] 丁涛, 徐锦忠. 高效液相色谱-二极管阵列检测法及高效液相色谱-电喷雾串联质谱法测定植物源性蛋白中残留的三聚氰胺[J]. 色谱, 2008, 26(1): 6-9.

[4] Michael S.F., Elizabeth R.T., et al.The determination of melamine in muscle tissue by liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Rapid Commun. Mass Sp., 2007, 21(24): 4027-4032.

（2014–07–25）

S859.84

A

1007-1733(2014)08-0012-02