屋尘螨致敏蛋白组分Der p1、Der p2和Der p10检测的临床意义

郑佩燕，孙宝清

(呼吸疾病国家重点实验室 呼吸疾病国家临床研究中心 广州呼吸疾病研究所 广州医科大学附属第一医院变态反应科，广州 510120)

1964年，Voorhort等提出螨是屋尘中主要的变应原[1]，此后螨作为吸入性抗原在变态反应性疾病中所占的地位逐渐被重视。螨的分泌物、排泄物及其尸体降解产物等都是引起变态反应性疾病的气传变应原，可引发I型变态反应，如螨性变应性哮喘、变应性鼻炎、变应性皮炎、荨麻疹等，且发病率有逐年增高的趋势，已被世界卫生组织列为当前世界性的重大公共卫生问题之一[2]。近年来，变态反应性疾病的发病率呈逐年增高趋势，而组分变应原在变态反应性疾病诊断和治疗中具有独特的优势和前景，正成为此领域研究的热点之一。在临床上，特异性变应原IgE检测对诊断变态反应性疾病的特异性和敏感性已得到很多研究的认同。然而，变应原IgE组分检测对临床诊断的意义和作用，国内外均研究较少。本文欲从屋尘螨组分IgE在变态反应性疾病体外诊断中的作用探讨组分分析在的诊断中的可能意义和作用，就屋尘螨主要组分Der p1、Der p2和Der p10的相关研究进展做一综述。

尘螨组分研究现状

尘螨(Dermatophagoides， house dust mite)是最重要的常见吸入性变应原之一，特别是屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)和粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae)，全球人口约20%和超过50%变态反应性疾病患者对这2种变应原存在变态反应[3-4]。尘螨是最常见触发哮喘和变应性鼻炎的变应原[5-6]，Der p1和Der p2是尘螨的主要变应原，其敏感性IgE检测和临床意义已有很多研究。90%以上对屋尘螨存在变态反应者对这2种组分均有变应性[7]。研究已经分离出20多种屋尘螨组分，但只有少数几种组分有所研究[8]。这些变应原组分中，Der p10为原肌球蛋白，已经受到广泛关注，因为它是无脊椎动物产生交叉反应的变应原[9]，特别是对海鲜。研究显示，Der p10是一种导致全身性严重变态反应的重要变应原[10]。有研究表明，不同人群对屋尘螨变应原组分变应原存在差异性，使用不同变应原组分进行特异性免疫治疗(specific immunotherapy，SIT)时，其临床效果也不同[11]。

1988年，Chua等[12]成功合成了Der p1变应原DNA克隆序列，并证明了它可编码包括222个氨基酸残基的蛋白序列，其相对分子质量为25000，包含1个潜在的N末端糖基化位点。该cDNA还可编码1个13个残基的前区及1个不完整的单肤链。此序列与动植物半胧氨酸蛋白酶有高度的同源性，尤其是在构成活性位点处的残基。用Southern法分析其基因序列显示，该变应原为非邻接的基因所编码。

Der p1属于半胱氨酸蛋白酶家族，人们利用其他半胱氨酸蛋白酶的X射线晶体结构构建了Der p1的模型。Der p1是与临床相关最密切的蛋白质，它与螨过敏症患者IgE的结合率达到70%～80%，Der p1大量存在于屋尘螨排泄的粪团中(每个颗粒约含0.1 ng)，且占屋尘螨提取液IgE的50%以上[13-14]。屋尘螨过敏患者的住所可以检测到高水平的Der p1，尘螨过敏患者的肺泡灌洗液中可以检测到纳克级的Der p1，提示黏膜中Der p1浓度可能达到毫克级水平。进入呼吸道后，Der p1可在1 min内迅速从排泄物小球中洗脱，而气道液体中高水平谷胱甘肽可能对Der p1活性起保护作用。屋尘螨变态反应的发生率与屋尘中Der p1浓度和个体中IgE水平之间显著相关。研究发现，正常人体内仅有低浓度的抗Der p1 IgG抗体存在，而大部分屋尘螨皮试阳性的成人哮喘患者和超过90%的尘螨过敏者有Der p1特异性IgE、IgA和IgG抗体存在[15]。Der p1特异性IgE抗体可以保护Der p1免受内源性蛋白酶的影响，并引导Der p1至细胞表面与受体结合。随着屋尘中Der p1水平的增加，屋尘螨致敏的危险性也显著增加。哮喘患者Der p1水平的季节性变化也和气道高反应性有关，而Der p1水平可能在夏末和秋季到达峰值[16]。Der p1半胱氨酸蛋白酶活性的重要性还在于其可增强体内总IgE和Der p1特异性IgE的合成能力[17]。CD8+T细胞抑制IgE产生，通过诱导向辅助T细胞1的免疫偏移抑制吸入变应原的变态反应。值得注意的是，Der p1诱导的CD 25水解对于CD8+T细胞存在强烈的抗增殖作用[18]。这说明Der p1的蛋白酶活性有利于IgE合成，通过消除CD8+T细胞减少对IgE的抑制作用。

1990年，Chua等[19]又通过变态反应患者血清IgE修饰放免分析的方法，从Der p cDNA组成的lambda gtll基因库中筛选分离出Der p2克隆。重组Der p2的cDNA序列编码129个氨基酸残基，相对分子质量为14 000，无N端糖基化作用位点，它可在大肠杆菌中表达为1种有谷胱甘肽-S-转移酶活性的融合蛋白[20]，并可在酵母菌中表达为1种与转化酶信号肽相融合的重组蛋白[21]。将该克隆序列在大肠埃希氏杆菌中表达，生成的Der p2与17份螨过敏患者血清中的14份反应，说明该变应原亦为屋尘螨的主要变应原之一。第2组尘螨变应原在诱发变态反应疾病方面与第1组变应原同样重要。Der p2与螨过敏患者的IgE结合率约为80%。对第2组变应原组分抗体的研究表明，此组抗原与消化道和其他未被鉴定的结构有关。以往人们曾提出，第2组变应原组分是溶酶体酶，其与附睾蛋白质的1个家族相似，可能是附睾分泌物，而雄螨生殖道内可形成大部分此种物质。Der p2完全由若干以单结构域免疫球蛋白折叠的片段组成，与转谷氨酰胺酶第8凝血因子的第3、4结构域在结构上高度同源。

在cDNA表达文库中进行IgE筛选，分离出了Der p10，相对分子质量为33 000。cDNA克隆分析表明，Der p10与动物原肌球蛋白有很高的同源性，与无脊椎动物原肌球蛋白的序列同源性为65%，有75%的序列与其他节肢动物的原肌球蛋白同源，有60%与哺乳动物的原肌球蛋白同源。Der p10与胰蛋白酶有45%的一致性，与糜蛋白只有32%的一致性。Der p10和Der f10相比，在全序列中只有3个氨基酸不同，序列一致性达98.5%，而他们与其他变应原相比只有80%的序列一致性。研究已经证实，原肌球蛋白与海产品变应原有临床相关性，但作为屋尘螨的原肌球蛋白Der p10还没有详细的报道。现已明确，提纯重组的Der p10等价于与IgE反应的天然Der p10，并对其与屋尘螨过敏患者的IgE反应性和变应性活动进行了评估[22]。

尘螨组分在变态反应性疾病体外诊断的作用

组分变应原诊断是目前变态反应性疾病诊断领域最先进的技术。该技术通过定量检测单个、纯化变应原分子的特异性IgE使变态反应性疾病的诊断更加精确。每种变应原都含有多种蛋白质组分，且每种组分的含量和变应原性也是不同的。这些变应原蛋白组分可以根据其结构的相似性分成不同蛋白质家族。同一蛋白质家族的蛋白组分也具有相似的稳定性和变应原性。目前，已发现与变态反应有密切关系的蛋白质家族包括PR-10蛋白、贮藏蛋白、LTP非特异性转脂蛋白、碳水化合物标记物CCD、前纤维蛋白、原肌球蛋白、血清蛋白等[23]。如Bet v1是桦树花粉的主要变应原组分，属于PR-10蛋白质家族[23-24]，其相同家族的蛋白组分在蔬菜和水果中广泛存在，可以导致桦树花粉-食物变态反应。

变应原蛋白组分抗原性的强弱与其特异性IgE的结合能力及其浓度有关。Der p1、Der p2和Der p10作为屋尘螨的主要变应原组分与变态反应性疾病有重要的联系。研究表明，Der p1具有半胱氨酸蛋白酶活性，可能引起气道表皮细胞脱落、细胞因子释放和促进变应原分子穿越表皮细胞[25]。同时，屋尘螨过敏的鼻炎和哮喘儿童屋尘螨特异性IgE水平与Der p1、Der p2特异性IgE水平正相关[15]。Der p2特异性IgE水平明显高于Der p1，提示Der p2拥有更高的免疫活性。免疫治疗后，首先出现Der p2特异性IgE水平降低，而Der p1特异性IgE水平需要更长时间的免疫治疗后才会出现降低[11]。

有研究显示，在47例有症状的尘螨过敏患者中，57.4%显示Der p1和Der p2特异性IgE阳性，6.4%仅对Der p1特异性IgE阳性，8.5%仅对Der p2阳性，而27.6%显示对Der p1和Der p2特异性IgE均为阴性[26]。研究表明，95%欧洲中部尘螨过敏患者主要是对Der p1和Der p2过敏，其他则表现出对其他组分如Der p10过敏[27]。有研究者从广州、南京、成都和沈阳4个城市收集100份血清标本，选用标本几乎均为屋尘螨单一特异性IgE阳性，且检测结果大于50 kUL，用变应原芯片法检测103种变应原组分，结果显示Der p1和Der p2为主要变应原，其特异性IgE阳性率分别为95%和94%，而Der p10特异性IgE阳性率仅为2%[28]。Resch等[22]通过对1322例屋尘螨IgE阳性的患者研究显示，Der p10阳性率为15.2%；Der p10阴性者主要是Der p1和或Der p2阳性；而Der p10阳性者除了主要的变应原(Der p1和Der p2)阳性外，其他屋尘螨组分也呈阳性。Der p10引起变态反应症状的患者一般较少，但可通过检测Der p10来确定屋尘螨过敏患者的临床症状是否有与Der p10致敏有关。Der p10可能是除了Der p1和Der p2外，屋尘螨过敏患者体内另1种与临床症状相关的诊断标记变应原。Resch等[22]认为，对这类患者进行SIT时，需要注意其疗效。

综上，Der p1和Der p2是屋尘螨的主要致敏组分，且不同人群的反应模式和分布也不同，也提示Der p1、Der p2 特异性IgE的临床检测在脱敏患者选择和SIT监控中有重要作用。Der p10不是屋尘螨的主要致敏组分，而是交叉反应的主要致敏蛋白，提示Der p10可作为屋尘螨与其他变应原存在交叉反应的监测致敏组分。

尘螨组分交叉反应性

对于任一变应原，其所含变应原组分又可以分为特异性组分和交叉反应性组分。所谓特异性变应原组分基本上是指该变应原所独有的，仅能在有限的相关物种间中找到。如果对特异性组分过敏，则表示相应的变应原是引起临床症状的主要原因。

粉尘螨和屋尘螨存在高度的交叉反应性，绝大多数尘螨患者都是屋尘螨和粉尘螨共同致敏。目前，尘螨中被确认的变应原组分有20多种，并且根据其生化组成和同源性等分为多个组[29]。其中，Der p1组分属于第1组，主要存在于屋尘螨排泄物中。Der p2组分属于第2组，主要存在于屋尘螨体内。Der p1和Der p2 被认为是80%以上屋尘螨过敏患者的主要致敏组分[15，30]。粉尘螨第1组变应原组分Der f1和Der p1可以诱导交叉反应，而Der f2和Der p2几乎完全交叉反应[31-32]。Der p10为尘螨原肌球蛋白，Der f10和Der p10有98%的同源性[33]，广泛存在于尘螨肌肉和非肌肉细胞中，它们存在交叉反应的结论已确定。

热带无爪螨(Blomiatropicalis)存在于热带和亚热带地区的尘土中。在新加坡和哥伦比亚，热带无爪螨浸液可轻度至中度抑制尘螨与其特异性IgE的结合，反之亦然。通过交叉免疫电泳发现，屋尘螨与热带无爪螨存在2至4种相似变应原。通过点印迹抑制发现，Der p1、Der p2与热带无爪螨的变应原交叉反应性不高，FAST抑制实验、交叉免疫电泳/交叉酶免疫电泳表明，这两种螨间的交叉反应性为轻度至中度。重组的Blo t5与重组的Der p5仅有中度的免疫交叉反应，Der p10与Blo t10之间的序列同源性为95%。因此，在热带和亚热带地区进行螨检查时，应该注意检查热带无爪螨。

Der p10蛋白质结构与无脊椎动物中的原肌球蛋白非常相似，如虾，龙虾，螃蟹，蟑螂和其他软体动物[34-35]。Der p10因其广泛的交叉反应性特点，除在螨虫过敏患者中呈阳性，且在蟑螂、虾蟹类和贝类食物的交叉过敏中也发挥重要作用。尘螨与虾之间存在临床相关的交叉反应，与屋尘螨有交叉反应的虾过敏患者起码对1种虾过敏，而原肌球蛋白是起积极作用的变应原。另外，在丝虫感染的患者中也发现了Der p10特异性IgE和IgG[36]。尘螨与血吸虫也有交叉反应性，与其交叉反应性相关的蛋白是副肌球蛋白和谷胱甘肽转移酶。蜗牛、甲壳动物(如虾)、蟑螂、衣鱼和摇蚊和其他螨变应原与尘螨变应原间的交叉反应已有免疫化学的研究证据[33]。在交叉反应的抑制试验中，尘螨浸液是强烈的抑制因子，表明在致敏的变应原中尘螨是主要的来源。尘螨变应原和其他无脊椎动物变应原的交叉反应可导致或加重食物过敏(如蜗牛、虾等)。

结论与展望

对致敏蛋白组分特异性IgE检测，可以明确特异性的致敏标记物和交叉反应性的标记物，区分由交叉反应或由共同致敏引起的变态反应性疾病。通过确认患者致敏组分变应原可帮助临床工作者评估变态反应的临床风险，区分变态反应性疾病患者和因交叉反应所致症状患者，进而能够对变态反应性疾病患者进行SIT。

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