蜜环菌多糖的研究进展

史国生，程春雷

(山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250101)

蜜环菌又名榛蘑，是一种在夏、秋季生长，能兼性寄生于多种植物的真菌，属于担子菌门、伞菌目、白蘑科。蜜环菌具有根腐特性，但对某些植物如中药天麻和猪苓，必须依靠蜜环菌的侵染才能生长繁殖[1]。蜜环菌含有氨基酸、微量元素、多糖、倍半萜类化合物等成分，其中蜜环菌多糖是蜜环菌具有多种药理活性的主要物质基础[2]。现将其活性多糖的理化性质、药理作用等方面的最新研究进展报道如下。

1 蜜环菌多糖的成分

由于蜜环菌的培养方法、提取工艺不同，不同学者得到的结果也不尽相同。洪毅等[3]从蜜环菌菌索中分离得到的多糖，经水解确定产物为D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-木糖和半乳糖醛酸。余晨晨等[4]利用紫外、红外光谱、气相衍生化分析蜜环菌发酵液中水溶性多糖的结构，结果表明，水溶性多糖成分单一，均为吡喃型葡萄糖。刘晓杰等[5]采用分布醇沉和葡聚糖凝胶(Sephadex G-200)色谱法对蜜环菌发酵液进行分类纯化，用高效液相色谱(HPLC)法进行分子量测定，采用1 -苯基-3-甲基-5 -吡唑啉酮将单糖进行衍生测定。此方法共获得2 种均一性多糖(AMFP-1，AMFP-2)，峰位分子量分别为812939 和596217，AMFP-1 主要由半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖组成，而AMFP-2主要由半乳糖醛酸、半乳糖、木糖组成。

2 蜜环菌多糖提取工艺的优化

蜜环菌多糖具有较多的活性，因此其提取工艺也成为研究热点。武录平等[6]用热水浸提法和超声波提取法对蜜环菌子实体进行了对比研究，并采用三因素三水平的正交试验将提取条件进行了优化，最佳工艺参数为料液比1 ∶50、温度40 ℃、提取时间6 h，得率达5.96%;超声法提取的最佳工艺参数为料液比1 ∶30、超声时间35 min、功率360 W，提取率比水提法略低。随着提取工艺研究的不断深入，张帆等[7]在单因素试验的基础上，选取超声时间、超声温度、液固比3 个因子进行三因素三水平的Box-Behnken 中心组合设计，以多糖提取率为响应值进行试验，并用响应面分析方法对工艺参数进行优化，得到的优化提取工艺条件修正后为液固比10 ∶1、超声时间22 min、超声温度77 ℃，最终蜜环菌多糖的提取率采用超声后其提取率升高了10%左右。这主要是由于超声波促使样品中偶极分子旋转而导致弱氢键破裂及离子迁移，加速了溶剂对样品的渗透，并使多糖溶解于溶剂中;此外，超声具有生物效应，会引起样品细胞膜破裂，从而加速多糖从细胞中的释放。也有研究表明，在水提取法的基础上进行超声优化，多糖得率可增加6%左右，可将超声波法作为蜜环菌多糖提取的辅助手段。

3 蜜环菌发酵条件的优化

蜜环菌的发酵条件对其多糖的含量有重要影响。余晨晨等[8]以苯酚-硫酸法测定多糖得率为评价指标，系统地研究了蜜环菌的最适氮源。研究结果表明，红薯粉和豆粕组合时最适合产多糖，玉米浆和玉米粉的组合菌丝体的得率最高。发酵培养基中的碳氮源是影响多糖产量的重要营养要素，在试验中，通过对14 种不同类型的碳氮源系统的进行筛选，发现天然类培养基的多糖和菌丝体得率明显高于一般合成类的碳氮源。也有学者从筛选菌株开始，确定了最佳液体发酵培养时间和碳源、氮源的组合。研究结果表明，菌株的最佳发酵时间为7 d，根据菌丝干重和多糖得率综合分析，最适碳源和氮源组合为糊精+红薯粉，蚕蛹粉+玉米浆。温刚等[9]以蜜环菌胞外多糖为指标，对基本培养基组分进行了优化，具体的培养基组成为:蔗糖25 g/L，豆饼粉2.5 g/L，K2HPO41.5 g/L，KH2PO40.25 g/L，MgSO40.5 g/L，ZnSO40.03 g/L，FeSO40.02 g/L。利用此培养基发酵生产胞外多糖产量可达478.5 mg/L，是基本培养基的6 倍。

4 蜜环菌多糖的药理活性

4.1 降糖作用

操玉平等[10]根据纯化时洗脱液的不同，得到了水相(AMP-1)和盐相(AMP-2)2 种组分。研究表明，AMP-1 能明显降低四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖，且可使正常小鼠的糖耐量增加;同时，一定浓度的AMP-1 对四氧嘧啶损伤的大鼠胰岛素瘤细胞的分泌胰岛素和C 肽具有一定的促进作用。为进一步研究其降糖机制，徐宝奎等[11]以四氧嘧啶损伤胰岛素细胞，在培养液中加入AMP-1。结果表明，AMP-1 能剂量依赖性地提高细胞存活率，当质量浓度为400 mg/L 时，能恢复至正常水平。运用荧光显微镜、流式细胞仪进行检测表明，四氧嘧啶会导致胰岛素细胞凋亡，而AMP-1 具有一定的拮抗作用。通过Western blot 进行凋亡通路分析发现，四氧嘧啶会使胰岛素细胞bcl-2 蛋白表达量减少，bax蛋白表达升高，而AMP-1 的加入会拮抗这种改变。可见，AMP-1可通过线粒体通路拮抗四氧嘧啶引起的胰岛素细胞凋亡。

4.2 免疫调节作用

王惠国等[12]研究表明，蜜环菌多糖是一种具有提高机体免疫力的免疫调节剂。小鼠经腹腔注射给予不同剂量的蜜环菌多糖，对照组给予等量的0.9%氯化钠注射液，每天给药1 次，给药14 d。给药结束后，用腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验、炭粒廓清试验观察小鼠吞噬细胞的吞噬能力，采用MTT 法测定小鼠脾脏T 淋巴细胞增殖能力，用血清溶血素形成试验观察蜜环菌多糖对小鼠特异性体液免疫功能的影响。结果表明，腹腔注射蜜环菌多糖后，小鼠吞噬细胞的吞噬功能、脾脏T 淋巴细胞的增殖能力、小鼠血清中特异性抗体含量均明显高于阴性对照组(P ＜0.05)。为进一步了解蜜环菌多糖增强免疫力的机制，王惠国等[13]用形态学方法测定各组小鼠在植物血凝素(PHA)诱导下淋巴细胞转化率，用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定各组小鼠血清中白细胞介素2(IL -2)、转化生长因子βl(TGF -βl)水平。结果表明，蜜环菌多糖具有提高小鼠淋巴细胞转化率，增加血清中IL -2 水平，并同时下调血清中TGF -βl水平的作用[13]。此研究提示，蜜环菌多糖可通过调节小鼠免疫细胞及免疫分子的作用，增强小鼠的免疫功能。

4.3 抗阿尔茨海默病(AD)作用

AD 俗称老年痴呆症，是一种中枢神经系统退行性病变，具体发病机制不明，但近年的研究发现，自由基损伤所造成的神经元损伤是引起AD 的重要原因之一。有研究报道，复方天麻蜜环菌片对AD 有一定疗效，可显著提高AD 患者的简易精神状态检查量表(MMSE)和简易智能量表(HDS)评分，明显改善临床症状，降低神经功能损伤积分，改善日常生活能力。

为进一步阐明其抗AD 的机制，邱家权等[14]和殷银霞等[15]研究了蜜环菌多糖含药血清对Aβ 25-35 及过氧化氢诱导PC12 细胞的保护机制。邱家权等[14]用蜜环菌多糖制备大鼠含有血清，在Aβ 25-35 诱导PC12 细胞损伤模型的基础上加入蜜环菌多糖含药血清，采用比色法检测培养液中乳酸脱氢酶的活力、丙二醛含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力。结果表明，不同浓度的含药血清对Aβ 25-35 损伤的PC12 细胞的存活率有提高作用，5%浓度的含药血清可明显降低乳酸脱氧酶(LDH)活力、丙二醛(MDA)含量，提高SOD 活力。殷银霞等[15]改用过氧化氢损伤PC12 细胞模型得到了相似的结果。为进一步阐明蜜环菌多糖的抗氧化作用，朱显峰等[16]采用分光光度法系统地研究了其对清除羟基自由基(·OH)、超氧阴离子(O2-)和DPPH 自由基能力，并且与抗坏血酸、TBHQ 进行了对比。蜜环菌多糖对·OH 的清除能力与抗坏血酸、TBHQ 相当，对O2-清除能力优于TBHQ，但弱于抗坏血酸，对DPPH 清除能力强于抗坏血酸和TBHQ。武录平等[17]对蜜环菌子实体多糖进行了分离纯化，将粗多糖通过乙醇沉淀分级得到3 个组分多糖T30、T60 和T80。T30 经凝胶柱(sephadexG-150)层析获得2 个纯多糖组分T301 和T302;T60 经凝胶柱(s 即hadexG-50)层析获得一个纯多糖组分T601，对蜜环菌多糖T30I 和T601 进行体外抗氧化试验。结果表明，2 种多糖都具有一定的抗氧化活性，T301 的效果优于T601，表明蜜环菌多糖的生物活性与多糖的分子量大小有一定关系。以上研究表明，蜜环菌多糖有较强的清除自由基、抗氧化能力，这可能是其抗AD、延缓衰老的机制之一。

4.4 抗衰老作用

蜜环菌多糖能部分逆转D-半乳糖记忆力下降等衰老行为，并能降低小鼠体内NO 和MDA 含量。秀丽隐杆线虫是广泛应用于遗传学、发育生物学、细胞生物学等领域的模式生物，与人类基因的同源性达到80%，其生命周期短，易繁殖，是进行衰老研究的理想模式生物模型。陈亮稳等[18]以生物秀丽隐杆线虫作为活体模型，测定蜜环菌多糖对线虫在正常培养条件下的生存期与后代平均数量，氧化应激条件下的存活率和热休克蛋白16.2(HSP-16.2)、SOD-3 的表达影响。结果表明，在正常培养条件下，蜜环菌菌索多糖(AMP-1 及AMP-2)可显著延长秀丽隐杆线虫的生存期，对其生殖力没有损害;在氧化应激条件下，显著提高秀丽隐杆线虫HSP-16.2 和SOD-3 的表达。

4.5 抗癌作用

Wu 等[19]从蜜环菌体中分离纯化了一水溶性多糖，该多糖含用高效凝胶色谱分析其相对分子质量为4.6 ×105，而且主要由D-葡萄糖组成。体外研究发现，该多糖对A549 肿瘤细胞有很强的抑制作用，能引起肿瘤细胞凋亡，使细胞阻滞在G0/G1期。研究其机制发现，该多糖能使肿瘤细胞的线粒体膜电位下降，因而使细胞色素C 从线粒体释放，同时激活caspase-3 和caspase-9，从而诱发A549 肿瘤细胞凋亡。

5 结语

蜜环菌是我国传统的药食两用真菌，其在滋补防病的应用历史悠久。近几年来，真菌多糖的生物活性越来越引起大家的重视，同样蜜环菌多糖的提取、结构鉴定、药理活性及活性作用机制也成为研究热点。目前，已有天麻蜜环菌片、脑心舒口服液等药品在临床使用，而且有蜜环菌饮料、糖浆等保健品上市。随着蜜环菌多糖研究的不断深入，一定会有更多制剂开发出来，更好地服务于人类健康。

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