白介素7在原发性干燥综合征患者唇腺组织中的表达及其临床意义

何春华，张 建，邹 霓

原发性干燥综合征(primary Sjögren′s syndrome，pSS)是一种主要累及外分泌腺体，发病基础是免疫功能紊乱，T、B淋巴细胞活化增殖，产生大量免疫球蛋白和自身抗体的慢性系统性自身免疫病。可同时出现肾脏、肺脏、甲状腺和肝脏等多种器官受累，部分患者可向恶性淋巴瘤发展。人白介素(IL)-7属于促红细胞生成素家族Ⅰ型短链细胞因子，由152个氨基酸残基组成，是一种促进淋巴细胞生成的细胞因子。实验证实IL-7可通过刺激T细胞增殖、分化，维持T细胞存活，诱导单核细胞和B细胞的活化而对淋巴细胞发挥着重要作用[1-2]。目前IL-7在类风湿关节炎[3]、系统性红斑狼疮(SLE)[4]发病中的作用已有较多报道。本研究采用免疫组织化学方法检测pSS患者唇腺组织中IL-7的表达水平，探讨IL-7在pSS发病机制中的作用及临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2005年3月—2012年10月滨州市人民医院风湿免疫科门诊及住院的pSS患者30例为pSS组，均符合2002年干燥综合征(SS)欧洲分类标准。其中男2例，女28例；年龄34～70岁，平均(44±19)岁；病程4个月～13年。另选择同时期颌面部创伤和唇腺囊肿患者5例为对照组，其中男1例，女4例；年龄23～53岁，平均(43±17)岁。两组性别及年龄均具有均衡性。

1.2 主要试剂 兔抗人IL-7单克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)及SP免疫组织化学试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)。

1.3 免疫组织化学法检测唇腺组织中IL-7的表达 唇腺石蜡组织切片常规脱蜡，过无水乙醇，3%过氧化氢室温下作用10 min；水化后，以pH 6.0的1 nmol/L 柠檬酸钠微波热修复，加封闭血清后，分别加入4 ℃湿盒过夜，再加入链霉卵白素标记的羊抗兔IgG，置湿盒中室温30 min，而后加入与生物素结合的辣根过氧化物酶，室温30 min，二氨基联苯胺(DAB)显色2 min，自来水冲洗，苏木素复染，脱水，中性树胶封片。镜下观察胞质有棕黄色颗粒沉着者为阳性。切片在400倍显微镜下随机选择10个视野(每个视野计数100个细胞)，计算阳性着色细胞数百分比，最后求其均值。表达强度采用半定量方法进行评价，标准为：-(没有表达)，+(1%～25%)，+ +(26%～50%)，+ + +(50%以上)。

1.4 HE染色法检测唇腺组织中淋巴细胞浸润情况 按Chisholm标准进行分级：Ⅰ级：1个淋巴细胞浸润灶/4 mm2；Ⅱ级：2个淋巴细胞浸润灶/4 mm2；Ⅲ级：3个淋巴细胞浸润灶/4 mm2；Ⅳ级：4个及以上淋巴细胞浸润灶/4 mm2。

1.5 血清指标检测

1.5.1 采血 抽取pSS患者及对照组静脉血8 ml，离心分离血清，置-70 ℃冰箱冻存待测。

1.5.2 自身抗体检测 间接免疫荧光法检测血清抗核抗体：滴加磷酸盐缓冲液(PBS)稀释待检血清标本为1∶20，吸取20 μl加于Hep-2细胞片上，标本片置于室温下孵育30 min，玻片置于玻片架上，PBS冲洗2次，各玻片滴加20 μl荧光标记的抗人IgG抗体，将玻片置于室温下孵育30 min，PBS冲洗，滴加20 μl甘油/PBS，盖玻片覆盖，荧光显微镜下观察。结果判断：荧光显微镜下细胞核呈现黄绿色荧光为阳性染色细胞，不发荧光为阴性，抗原片中出现阳性染色细胞为抗核抗体(ANA)阳性，否则为阴性。免疫印迹法检测抗SSA抗体、抗SSB抗体，操作方法严格按产品操作说明书进行。

1.5.3 红细胞沉降率(ESR)检测 pSS患者及对照组静脉血约2 ml，采用魏氏法检测，将静脉血与枸橼酸钠按4∶1混合，加入魏氏管，记录ESR。

1.5.4 C反应蛋白(CRP)及免疫球蛋白检测 pSS患者及对照组静脉血约2 ml，运用免疫比浊法检测，将各标本置于全自动特种蛋白分析仪上，按仪器操作说明严格进行，记录CRP、IgG、IgM、IgA结果。

2 结果

2.1 实验室指标结果 30例pSS患者中26例(87%)ANA为阳性，23例(77%)抗SSA抗体阳性、11例(37%)抗SSB抗体阳性。ESR(39±32)mm/h，CRP(14±11)mg/L，IgG(25±11)g/L，IgM(2.3±1.9)g/L，IgA(3.8±1.6)g/L。

2.2 IL-7免疫组织化学染色结果 IL-7阳性产物定位于胞质，呈棕黄色，主要表达于导管、腺泡上皮细胞及淋巴细胞浸润灶(见图1)。pSS组29例呈阳性表达，阳性表达率为97%,对照组1例呈阳性表达，两组IL-7阳性表达率比较，差异有统计学意义(P=0.013，见表1)。

2.3 HE染色结果 pSS唇腺组织中腺泡小叶及导管周围灶性淋巴细胞浸润(1个灶：>50个淋巴细胞/4 mm2)，腺泡破坏，萎缩，导管扩张，纤维结缔组织增生，脂肪浸润(见图2)。

2.4 IL-7阳性细胞数与淋巴细胞浸润灶数相关性分析 pSS患者唇腺组织的IL-7阳性细胞数与淋巴细胞浸润灶数呈正相关(r=0.807，P<0.01，见表2)。

2.5 IL-7阳性细胞数与实验室指标相关性分析 pSS患者唇腺组织的IL-7阳性细胞数与ESR呈正相关(P<0.01)，与其他实验室指标无相关性(P>0.05，见表3)。

3 讨论

pSS患者唇腺组织破坏的具体机制至今尚未完全阐明，近年研究表明，免疫及炎性相关因素在pSS的发病过程中起了重要作用，而由活化的免疫细胞和一些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的炎性相关因子具有极为广泛的生物学效应，在介导和调节免疫应答及炎性反应方面发挥了重要作用[5]。近期国外研究证实，白介素家族中的IL-7及其受体(IL-7R)在pSS患者唇腺组织及血清中存在高表达，介导了疾病的发生与发展，与pSS关系密切，在SS的发病中起到重要作用，是当前研究较为活跃的领域[6]。

图1 IL-7高表达于pSS唇腺组织导管上皮细胞、腺泡上皮细胞及淋巴细胞浸润区(免疫组织化学法，×400)

Figure1 High expression of IL-7 in pSS labial gland tissue ductal epithelial cells,acinar epithelial cells and lymphocytes infiltration area

图2 pSS患者唇腺组织中淋巴细胞浸润情况(HE，×400)

Figure2 Lymphocyte infiltration in labial gland tissues in pSS patients with HE staining

表1 两组IL-7表达情况(例)

表2 IL-7阳性细胞数与淋巴细胞浸润灶数相关性分析结果(例)

Table2 Relationship between lymphocytic infiltration focus and the the positive cells of IL-7

淋巴细胞浸润灶数例数IL-7 - + ++ +++Ⅰ级21100Ⅱ级30300Ⅲ级100262Ⅳ级1500312

表3 IL-7阳性细胞数与实验室指标相关性分析结果

Table3 Analysis of the correlation between the positive cells of IL-7 and laboratory indexes

ESRCRPIgGIgMIgAr值 05460217032101390191P值<0010259005603430317

注：ESR=红细胞沉降率，CRP=C反应蛋白

IL-7是Namen等在1988年发现的主要由胸腺和骨髓基质细胞分泌的相对分子质量为25 000～28 000的糖蛋白，其由152个氨基酸残基组成，编码基因位于8q12-13，包含6个外显子和5个内含子。研究发现，IL-7通过诱导T细胞相关受体的表达而介导了Th1和Th17细胞的分化，从而增加了IL-2、IL-17、IL-22等相关细胞因子的分泌，而这几种细胞因子又是导致SS发病的重要炎性因子,阻断IL-7R能明显降低Th1和Th17细胞的活性，从而降低相关炎性因子的表达[7]。Katsifis等[8]采用免疫组织化学、实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)等方法对确诊pSS患者及对照组人群进行比较后证实：pSS患者涎腺组织中IL-17及相关因子的表达与炎性反应的程度及临床表现相关。Gonzalez-Quintial等[9]发现，在SLE小鼠模型中，随着成纤维网状细胞的增殖IL-7表达亦增加，并促进自身反应性T细胞增殖及自身免疫性疾病的进展，即使是在疾病的进展期，应用IL-7R拮抗剂仍可抑制自身反应性T细胞活性并遏制疾病发展。这表明调节IL-7的平衡或许可成为一种治疗或缓解自身免疫性疾病的方法。IL-7R+T细胞参与了SS患者唇腺组织增强的炎性反应，尤其与IL-7的表达增高有关[10]。Nguyen等[11]在非易患SS的C57BL/6J小鼠(6～8周龄和15～17周龄)涎腺组织中注入表达IL-17A的血清5型腺病毒载体，制成SS样的动物模型，最终发现了淋巴细胞的浸润、细胞因子水平升高及涎液流量降低等改变，进而表明IL-17A是涎腺功能受损的重要炎性因子,抗IL-17的靶向治疗可能对改善腺体功能有效[12]。IL-7Rα抗体通过抑制IL-7R功能阻断了IL-7/IL-7R/Th17之间的信号传导，减少了相关炎性细胞因子的产生，从而阻断了炎性反应过程，因此通过改变调节IL-17细胞增殖分化的上位细胞因子IL-7/IL-7R可能为治疗SS及其他自身免疫性疾病提供有效的新思路。Quartuccio等[13]研究证实人B淋巴细胞刺激因子(BlyS)与SS患者的免疫学指标、B细胞病理性克隆、疾病活动度及B细胞淋巴瘤关系密切，指出BlyS在SS发病中具有重要作用。在风湿性疾病的炎性组织中，巨噬细胞、树突细胞(DC)和成纤维细胞均可分泌IL-7，伴随IL-7高表达的有T细胞分化刺激因子、炎性趋化因子、黏附因子等及异位淋巴样聚集体形成，提示IL-7是重要的促炎性递质。IL-7既可通过自身对T、B淋巴细胞作用的调节发挥其在SS中的重要作用，还可通过诱导其他细胞因子来调节其效应，以上研究结果都显示炎性相关因子在风湿性疾病中的重要作用[14]。故以IL-7/IL-7R为治疗靶点在风湿性疾病的治疗中具有重要意义。

本研究采用免疫组织化学法检测了IL-7在pSS患者及对照者唇腺组织中的表达，并分析了其与唇腺组织中淋巴细胞浸润及其他实验室指标的关系。结果显示，pSS患者唇腺组织中有IL-7高表达及大量的淋巴细胞浸润，而对照组低表达，并且IL-7阳性细胞数与淋巴细胞浸润灶数呈正相关，表明唇腺组织有无淋巴细胞浸润影响IL-7是否表达及表达量，而表达的IL-7反过来也对浸润的淋巴细胞的发育、增殖起到重要的作用，证实IL-7参与了pSS炎症损伤的过程。同时也发现了IL-7在pSS唇腺组织表达的特点，即IL-7高表达于导管、腺泡上皮细胞及淋巴细胞浸润区，且呈胞质表达，提示其与导管上皮细胞、腺泡细胞及浸润的淋巴细胞关系密切，在pSS发病中发挥重要作用，与已知的IL-7可通过刺激T细胞增殖、分化，维持T细胞存活，诱导单核细胞和B细胞的活化而对淋巴细胞发挥重要作用的功效相吻合。

ESR是反映体内炎症活动的指标之一，本研究证实IL-7阳性细胞数与ESR呈正相关，提示IL-7的表达水平与pSS的急性炎症密切相关。但是本研究未发现与pSS活动程度密切相关的其他实验室指标如血清免疫球蛋白水平的关系，可能与两者所介导的炎症不同阶段有关，可在今后的研究中进一步证实。

唇腺组织中淋巴细胞的聚集通常作为pSS诊断的一个重要组织学指标，但由于取材、染色等各因素及在实际操作中存在灵敏度或特异度不够强的缺点，可能影响诊断结果。

总之，本研究结果提示IL-7在pSS的发病中起到重要的作用，但由于实验条件所限，本研究未涉及pSS患者血清组织内IL-7表达情况，因此进一步明确其在血清内的表达情况，可能会为进一步探讨其在pSS具体作用机制以及与其他免疫细胞的相互作用提供实验基础，有可能对早期阻止病情进展，为治疗该类疾病提供新的思路。另外，pSS唇腺组织检测到IL-7的高表达,为以后将唇腺组织的IL-7检测作为SS的一个辅助诊断手段提供了初步的实验基础。

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