基因RFC-1多态性与神经管畸形发生的相关性研究

郭 丽，解 军

(1．临汾职业技术学院，山西 临汾 041000，2．山西医科大学，山西 太原 030001)

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是在基因组核苷酸基础上出现变异而引起的DNA序列多态性，有单碱基的变换、颠倒以及插入或缺失等。在基因组中平均每1 000 bp就约有一个SNP。SNP与致病基因的搜查、种群多样性的研究，特别是与人类的遗传特征密切相关，因此，SNP可广泛用于诊断学和治疗学。

神经管畸形(neural tube defects，NTDs)是神经管在胚胎发育过程中因闭合不全而引起的一种先天性缺陷性疾病［1］。颅骨闭合失败导致无脑畸形，是常见的致死原因;尾端闭合失败通常导致脊髓脊膜膨出。NTDs是最常见的出生缺陷，该病的发病机制受到遗传、环境、营养等多种因素共同作用，是交互影响而导致的结果，其中遗传因子的作用更为突出。神经管畸形可导致胎儿流产、死亡及新生儿死亡等严重后果，山西省发病率高达10‰［2］，严重影响新生儿的生存质量。在受孕前给母亲补充叶酸能够减低NTDs的风险。

叶酸衍生物是DNA的合成、细胞分裂、膜的生长、DNA甲基化所必需的，甲基化能在基因表达、染色体结构的维持中发挥作用，恰恰它们也正是胚胎发育的关键。动物模型实验提示叶酸盐的补充能对抗颅面畸形、神经管畸形的发生。

本研究通过检测样本的还原性叶酸载体(reduced folate carrier，RFC)基因多态性，预测了其蛋白质的空间结构，分析了其基因分型及频率与神经管畸形发生之间的相关性，为今后制定神经管畸形有效的预防和筛查方案提供一定的科学依据。

1 资料与方法

1．1 一般资料

选取2012年3月～2013年12月在山西省临汾市第一人民医院、儿童医院产科门诊进行产前检查的妊娠妇女539名。确诊孕有神经管畸形儿的30名孕妇为病例组，同一时期正常妊娠的健康孕妇509名为对照组，两组对象基本情况比较差异无统计学意义(P＞0．05)。见表1。

表1 两组基本情况对比表Table 1 Comparison of Basic Condition between the Case and the Control Groups

1．2 实验方法

1．2．1 采集样本 本研究对象抽取2 mL空腹静脉血，并进行抗凝处理。

1．2．2 提取 DNA 购买BioDev试剂盒，按照说明逐步从血液中提取DNA，保存在－20℃。

1．2．3 基因分型 由 TAKARA公司对 RFC-1基因A80G位点进行基因测序，将测序结果进行分型，并对其分析。

1．3 三级结构预测

应用Swiss Pdb viewer4．0软件对比分析野生型与突变型RFC-1三级结构预测及分析。

1．4 统计学方法

使用统计软件SPSS16．0进行统计分析，采用χ2检验对RFC-1 A80G多态性位点的基因型频率和等位基因频率的差异进行比较，Logistic回归分析计算相对危险度(odds ratio，OR值)和95%可信区间(95%CI)，提示各基因型发生神经管畸形的风险。

2 结果

2．1 基因型分析RFC-1 A80G位测序结果

2．2 三级结构的预测结果

根据RFC-1基因的外显子3的第80位出现一个高频G－A的点突变，使得氨基酸由精氨酸转化为组氨酸。预测突变结果可能的三级结构如图1。

2．3 RFC-1基因型的比较(见表2)

表2 两组RFC-1基因分型及等位基因频率的比较Table 2 Comparison of RFC-1 Gene Polymorphisms and Allele Frequency between the Case and Control Groups

RFC-1 80位基因型分布频率为神经管畸形儿孕妇组 AA15(50．0%)，AG10(33．3%)，GG5(16．7%)，对照组 AA40(80．0%)AG8(16．0%)，GG2(4．0%)，组间差异有统计学意义(χ2=8．386，P ＜0．05)。等位基因为神经管畸形儿孕妇组 A39(65．0%)，G21(35．0%)，对照组 A88(88．0%)，G12(12．0%)，组间差异具有统计学意义(χ2=12．117，P ＜0．05)。

RFC-1 80位与神经管畸形相关性分析:RFC-1 80位与AA基因型相比较，G等位基因和GG基因型的孕妇发生NTDs的相对风险明显增加，分别为3．567，95%CI(1．923 ～ 5．976)，OR=6．101，95% CI(1．331 ～21．609)，差异具有统计学意义(P ＜0．05)。

图1 三级结构预测结果Fig．1 Predicted Results of A Three－ dimensional Model

3 讨论

在我国流行病学调查中，山西省神经管畸形的发病率居全国首位，严重影响新生人口质量，制约经济发展，虽对孕妇进行孕期监测可以降低患儿出生率，但仍不能彻底消除。本研究从遗传学角度入手，以孕育神经管畸形儿的孕妇为病例组，孕育正常儿的孕妇为对照组，采取基因测序的办法［3］，对RFC-1基因在80位点由A-G突变进行了相关性研究，并对三维空间构象进行了分析。

研究发现，小量叶酸可以限制细胞分裂为甲硫氨酸的代谢，以增加孕妇机体血清中高半胱氨酸的含量。A80G是RFC-1常见的突变位点，它的突变直接或间接的影响基因活性降低，叶酸转运缺陷，从而引起与叶酸代谢相关疾病发生风险的加大。RFC基因是在小肠组织中表达的叶酸载体，是叶酸运输到细胞中必不可少的。当叶酸在小肠中吸收时，主要通过RFC途径完成。若RFC-1基因出现点突变，会导致精氨酸转化为组氨酸，改变其代谢途径，从而影响叶酸的吸收效率。

本研究结果显示，病例组 GG基因型频率(16．7%)显著高于对照组(4．0%)，且 OR 值为 6．101，提示发生NTDs的风险明显增大。说明在山西汉族人群中，RFC-1基因A80G多态性时发生NTDs的风险因素高。若能在怀孕前进行RFC-1基因A80G的多态性筛查，并及时在受孕前后给予GG基因型妇女口服足量的叶酸，可降低NTDs的发生率。

本次研究样本收集的例数较少，有一定的局限性，但本研究提供的数据表明了RFC-1和神经管畸形之间有相关性，叶酸代谢途径异常在NTDs中有重要作用，应该作为神经管畸形研究的潜在危险因素。

［1］ Van der Put NM，Steergers-Theunissen RP，Frosst P，et al．Mutated Methylen Etertrahydrofolate Reductase as a Risk Factor for Spina Bifida［J］．Lancet，1995，346(10):1070-1071．

［2］ Yali Shang，Hong Zhao，Bo Niu，et al．Correlation of Polymorphism of MTHFRs and RFC-1 Genes with Neural Tube Defects in China［J］．Birth Defects Research Part A Clinical and Molecular Teratology，2008，82(1):3-7．

［3］ Stegmann K，Boecker J，Richter B，et al．A Screen for Mutations in Human Homologues of Mice Exencephaly Genes TFAP2-alpha and Msx2 in Patients with Neural Tube Defects［J］．Teratology，2001，63(5):167-75．