注射用灯盏花素大鼠和豚鼠免疫毒性差异性比较

骆永伟，杨春雷，王忠辉，王 永，王 蓉，姜 娟，闫 晗，孙祖越

(1. 上海市计划生育科学研究所, 中国生育调节药物毒理学检测中心, 上海 200032; 2. 昆明龙津药业股份有限公司, 昆明 650101)

注射用灯盏花素大鼠和豚鼠免疫毒性差异性比较

骆永伟1,2，杨春雷2，王忠辉1，王 永1，王 蓉1，姜 娟1，闫 晗1，孙祖越1

(1. 上海市计划生育科学研究所, 中国生育调节药物毒理学检测中心, 上海 200032; 2. 昆明龙津药业股份有限公司, 昆明 650101)

目的 研究注射用灯盏花素在两种不同的动物种属及其反应体系上的免疫毒性差异。方法 按照《中药、天然药物免疫毒性(过敏性、光变态反应)研究的技术指导原则》的试验方法对注射用灯盏花素进行SD大鼠皮肤被动过敏试验和Hartley豚鼠全身主动过敏试验，比较注射用灯盏花素在大鼠和豚鼠体内的免疫毒性差异。结果 注射用灯盏花素剂量为5mg/kg、50mg/kg及500mg/kg时均未引起SD大鼠皮肤被动过敏反应阳性;注射用灯盏花素剂量为5mg/kg(豚鼠等效剂量)时引起50%动物弱阳性和50%动物阳性，50mg/kg时豚鼠全身主动过敏反应阳性率为100%。结论 注射用灯盏花素在两种动物体内表现的过敏反应存在着明显的差异，豚鼠全身主动过敏反应相对于SD大鼠皮肤被动过敏反应更敏感，与临床过敏反应发生率更具有一致性。

中药注射剂; 免疫毒性; 被动过敏试验; 主动过敏试验

灯盏花素(breviscapine)是从菊科植物短葶飞蓬(Erigeon speciosus)中分离得到的黄酮类有效成分，主要为灯盏乙素，具有增加心脑血管血流量、改善脑微循环、抗血小板聚集、抗氧自由基、增强肝脏解毒功能，保护糖尿病性肝脏、肾脏等作用，在临床上主要用于脑血栓、冠心病等疾病的治疗[1,2]。注射用灯盏花素是采用现代科学技术和方法，从灯盏花提取、纯化、精制而成的中药注射剂。中药注射剂作为中药现代化的一个标志，具有生物利用度高、起效快等特点，在危重疾病急救及感染性疾病等治疗上具有一定的优势。然而，近年来随着注射用灯盏花素等中药注射剂在临床上的广泛应用，不良反应报道也逐渐增多，中药注射剂安全性问题日益受到重视。灯盏花素的不良反应临床上主要以过敏反应为主，严重的可出现过敏性休克[3～5]。为探讨注射用灯盏花素引起过敏反应的差异, 本研究参照《中药、天然药物免疫毒性(过敏性、光变态反应)研究的技术指导原则》，采用SD大鼠进行皮肤被动过敏试验(PCA)和豚鼠全身主动过敏试验(ASA)，为临床提供毒理学资料。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠, 接收时体质量180～220 g，50只，雌雄各半，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供[SCXK(沪)2008-0016]。普通级Hartley豚鼠, 接收时体质量260～360 g，24只，雌雄各半。由上海市松江区车墩实验动物良种场提供[SCXK(沪)2007-0008]。大鼠及豚鼠分别在SPF级和普通级设施[SYXK(沪)2008-0027]饲养和实验，动物自由饮食。

1.2 试剂

注射用灯盏花素为淡黄色至黄色的疏松块状物，由昆明龙津药业股份有限公司提供(批号20100127)。牛血清白蛋白(Sigma公司, 批号091009)和伊文斯兰染料(Sigma公司, 批号1001388548)。

1.3 方法

1.3.1 剂量设计 注射用灯盏花素临床常用方式:静脉注射20～50 mg/次, 用250 m l生理盐水或500 m l体积分数5%或10%葡萄糖溶解后使用。按50 mg/人/次折算成大鼠的等效剂量约为5 mg/kg, 故大鼠被动过敏低剂量设置为5 mg/kg, 中、高剂量则分别设置为50 mg/kg和500 mg/kg; 同样方法换算豚鼠等效剂量为5 mg/kg，故设计豚鼠主动过敏低剂量为5 mg/kg, 高剂量为50 mg/kg。牛血清白蛋白为阳性对照组，大鼠和豚鼠给药剂量均为100 mg/kg，2 m l/kg给药。0.9%氯化钠溶液为阴性对照组。以上溶液均为现用现配。

1.3.2 被动皮肤过敏性试验 抗体制备阶段，20只SD大鼠, 根据体质量随机分为5组, 雌雄各半; 大鼠静脉给予注射用灯盏花素溶液，注射剂量分别为5 mg/kg(低剂量组)、50 mg/kg(中剂量组)和500 mg/kg (高剂量组)，隔日一次, 共3次。阴性对照组和阳性对照组分别给予生理盐水和牛血清白蛋白。末次致敏注射后第10天采血, 以2 000 r/min离心10 min,分离血清，混匀后，－20℃保存，两周内备用;被动致敏和激发阶段, 另取30只SD大鼠，根据体质量随机分为5组，雌雄各半，分组同抗体制备阶段。大鼠两侧背部剃毛，面积约3 cm×4 cm。上述各组抗血清用生理盐水稀释成1∶2、1∶8和1∶32; 在预先剃毛的左侧和右侧背部皮肤皮内分别注射各相应组别1∶2、1:8和1∶32稀释的抗血清0.1m l。24 h后，各组尾静脉注射与致敏剂量相同的激发抗原与1%伊文思兰染料，进行激发。30 min后麻醉处死各组动物, 剪取背部皮肤, 测量皮肤内层的蓝色斑点大小, 直径大于5 mm者为阳性。不规则斑点的直径为长径与短径之和的一半。

1.3.3 全身主动过敏试验 致敏阶段, 24只豚鼠静脉给予注射用灯盏花素溶液, 注射剂量为5 mg/kg (低剂量组)和50 mg/kg(高剂量组), 隔日一次, 共3次。阴性对照组和阳性对照组给药方法和给药体积同注射用灯盏花素高、低剂量组; 激发阶段, 末次注射后第12日一次激发, 注射用灯盏花素低剂量组和高剂量组激发剂量分别为20 mg/kg和200 mg/kg, 为致敏剂量的4倍。致敏期间, 每日观察每只动物的症状。初次、最后一次和激发当日测定每只动物的体质量。激发阶段, 静脉注射后30 min内详细观察每只动物的反应, 症状的出现及消失时间, 连续观察3 h。并根据全身致敏性评价标准分级[6]。“-”:过敏反应阴性(正常); “+”: 过敏反应弱阳性(躁动、竖毛、颤抖、搔鼻); “++”: 过敏反应阳性(喷嚏、咳嗽、呼吸急促、排尿、排粪、流泪);“+++”：过敏反应强阳性(呼吸困难、哮鸣音、紫癜、步态不稳、跳跃、喘息、痉挛、旋转、潮式呼吸); “++++”: 过敏反应极强阳性(死亡)。

2 结果

2.1 被动皮肤过敏试验

在抗体制备阶段和激发阶段，SD大鼠静脉给予注射用灯盏花素期间未观察到动物出现明显异常;激发30 m in后阳性对照组6只SD大鼠在1∶2抗血清注射点出现明显的直径大于5 mm的蓝斑，阳性率为100%(6/6)，5只SD大鼠在1∶8抗血清注射点出现明显的直径大于5 mm的蓝斑，阳性率为83.3%(5/6); 阴性对照组、注射用灯盏花素低剂量组、中剂量组和高剂量组动物皮肤内层均未见明显大于5 mm的蓝斑出现，阳性率为0(0/6)(表1)。

2.2 全身主动过敏试验

在致敏阶段和激发阶段，豚鼠静脉给予注射用灯盏花素期间未观察到动物出现明显异常; 激发后，阳性对照组6只动物在10 m in内均出现了不同程度的过敏反应，症状包括搔鼻、咳嗽、喷嚏、排尿、步态不稳、痉挛、旋转和死亡，为强阳性或极强阳性。其中3只动物死亡，剩余3只动物的过敏反应症状在45～75 min内基本恢复; 注射用灯盏花素低剂量组6只动物在激发后10 min内均出现了不同程度的过敏反应症状，其中3只动物出现搔鼻症状，为弱阳性；3只动物出现喷嚏和(或)排尿症状, 为阳性, 过敏反应症状在35～50 min内基本恢复; 注射用灯盏花素高剂量组6只动物在激发后10 min内均出现了不同程度的过敏反应症状，症状包括喷嚏、咳嗽和(或)排尿症状，为阳性，过敏反应症状在35～50 m in内基本恢复(表2)。

表1 大鼠被动皮肤过敏试验(PCA)结果

表2 注射用灯盏花素豚鼠全身主动过敏试验结果

3 讨论

注射用灯盏花素的临床不良反应主要以过敏反应为主，其过敏反应发生率约占其所有不良反应的70%。主要临床表现为轻者皮肤瘙痒、荨麻疹、过敏性皮炎, 重者出现过敏性休克[3～5,7～8]。由于中药注射剂受原料来源、采集季节、生产工艺、纯度与杂质含量等诸因素的影响，所以注射用灯盏花素引起不良反应的机制尚不明确。本试验SD大鼠被动皮肤过敏试验结果表明：注射用灯盏花素剂量为5 mg/kg、50 mg/kg及500 mg/kg均未引起阳性反应; 豚鼠全身主动过敏研究结果表明: 注射用灯盏花素剂量为5 mg/kg和50 mg/kg时动物全身主动过敏反应阳性率均为100%，说明注射用灯盏花素在两种动物体内表现的过敏反应存在着明显的差异，豚鼠全身主动过敏反应相对于SD大鼠皮肤被动过敏反应更敏感。

SD大鼠和豚鼠是分别是被动皮肤过敏试验和全身主动过敏中常用的两种实验动物，二者在注射用灯盏花素引起的过敏反应的差异说明二者对注射用灯盏花素的敏感性不同，与文献报道的不同品系的动物对特定的药物易感性有所不同相一致[9～10]。这种差异产生的原因与动物的遗传背景密切相关，具有Th2极化遗传背景的动物对实验性过敏性疾病呈现易感体质，从遗传学的角度看，SD大鼠本身并无明显的Th2极化遗传背景，在一定程度上反应了注射用灯盏花素SD大鼠皮肤被动过敏反应不易出现阳性结果。

《中药、天然药物免疫毒性（过敏性、光过敏反应）研究的技术指导原则》中规定，对于Ⅰ型过敏反应，静脉注射剂应进行主动全身过敏性试验和被动皮肤过敏性试验。然而，实际工作中面临的情况是许多中药注射剂过敏反应的临床报道与临床前安全性评价中动物实验结果不一致。采用临床上已发现过敏反应的药物，将同一批次的样品参照《中药、天然药物免疫毒性(过敏性、光过敏反应)研究的技术指导原则》进行动物的过敏试验，却未得出阳性结果。分析其原因，一方面与不同种属的动物敏感程度有关，另一方面也与中药注射剂具有多成分、成分又复杂的特点有关。因此，急需改进和提高现有临床前过敏试验评价方法，建立新的更为敏感、可靠的动物模型和过敏原检测技术方法，以提高临床前不良反应的预测水平，保证用药安全，是突破中药注射剂安全性评价瓶颈的途径，这为传统中药的发展和中药现代化的发展奠定坚实的基础，同时也是目前中药注射剂面临的最严峻的挑战。

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Comparison on Immunotoxicity Difference of Breviscapine Injection between Rat and Guinea Pig

LUO Yong-wei1, YANG Chun-lei2, WANG Zhong-hui1, WANG Yong1, WANG Rong1, JIANG Juan, YAN Han1, SUN Zu-yue1
(1. Department of Pharmacology and Toxicology ,Shanghai Research Institute of Planned Parenthood, National Evaluation Centre for the Toxicology of Fertility Regulating Drugs, Shanghai 200032, China; 2. Kunming Longjin Pharmaceutical Co., Ltd., Kunming 650101, China)

ObjectiveTo study the immunotoxicity difference of Breviscapine Injection between rat and guinea pig.M ethodsAccording to the Chinese traditional medicine, natural medicine immunity toxicity study technical directed principle, the PCA and ASA tests were carried out in order to compare the immunotoxicity difference between the two animals.ResultsThe results of the allergy testing showed that no positive symptom in SD rat occurred at all the doses of 5 mg/kg、50 mg/kg and 500 mg/kg of Breviscapine injection group in PCA toxicity study. While in ASA toxicity study, 50 percent animals appeared weak positive and 50 percent animals appeared positive at the dose of 5 mg/kg of Breviscapine injection group; and all appeared the positive symptoms at the high dose of 50 mg/kg group.ConclusionsCompared w ith the allergic response in animal study, there are significant difference between the PCA and the ASA toxicity study and the ASA is more sensitive and more conformity to the application in clinical.

Chinese traditional medicine injectas; Immunotoxicity; Passive cutaneous anaphylaxis test (PCA); Active systemic anaphylaxis(ASA)

R285Q95-33

A

1674-5817(2014)01-0025-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.01.005

2013-06-03

重大新药创制科技重大专项(2011ZX09301-005),上海市实验动物创新行动计划项目(11140901300)

骆永伟(1983-), 男, 硕士, 助理研究员,研究方向: 生殖药理毒理学与药物安全性评价, E-mail: luoyongwei2009@163.com

孙祖越, 研究员, 博士生导师, 研究方向: 生殖药理毒理与药物安全性评价, E-mail: sunzy64@163.com