高效液相色谱柱及其再平衡（译文）

李奕婧，李 冰，程春雷，王 杰（校对）

（1.滨州市食品药品检验检测中心，山东滨州256618；2.山东省食品药品检验研究院，山东济南250101）

高效液相色谱柱及其再平衡（译文）

李奕婧1，李 冰2，程春雷2，王 杰2（校对）

（1.滨州市食品药品检验检测中心，山东滨州256618；2.山东省食品药品检验研究院，山东济南250101）

韦伯斯特新大学词典对“迷信”的定义是“人们，尤其是对该方面感兴趣的团体，不加鉴别地奉行一种错误的观点”。色谱法中是否存在这些迷信呢？Ron Majors列出高效液相色谱（HPLC）中的迷信并提供一些证据以证明它们是错误的。

观点一：至少需要使用10倍柱容体积的流动相才能使色谱柱重新达到平衡状态。

作为液相色谱法工作效率的一个限制因子，平衡时间在梯度色谱技术中十分关键。梯度结束后，下一针进样前，色谱柱必须返回至起始状态。平衡色谱柱所用的时间越长，整个梯度运行的时间越长；此外，如果用比实际需要更长的时间，还会导致溶剂的浪费。现代的二维液相色谱法中，第一维色谱柱的流速在第二维色谱分析时并不为零，因此，二维液相色谱的流量是由次级色谱柱的流速决定的。一方面，如果平衡色谱柱只需要几倍柱体积的流动相，却使用10倍甚至以上，将使本来已经十分缓慢的色谱分析过程变得更慢；另一方面，如果再平衡时间过短，色谱柱未企稳，保留时间（鉴别组分的重要指标）的重复性就可能会受到影响。

目前已有许多关于再平衡时间的研究，本文从以下几点总结再平衡研究的主要成果。第一，平衡分为两个类型：可重复平衡和完全平衡。可重复平衡意味着可能没有实现完全平衡，但在实际应用中，对于使用了非缓冲洗脱液的非离子化溶质和使用了常见的三氟乙酸或甲酸添加剂的碱性化合物而言，如果其后续运行保留时间的重复性小于0.002分钟，可重复平衡就可以在两个柱体积内实现。倘若要使未封端的固定相在两个柱体积内快速达到完全平衡，需要在流动相中加入1%（V／V）的正丁醇；而封端的固定相，则不需要加入正丁醇。

Schellinger，Stoll和Carr［1，2］针对保留时间的重复性和色谱柱的再平衡，研究了反相液相色谱法中碱性化合物和中性化合物在具有缓冲能力的洗脱液中的快速梯度洗脱，并对完全平衡条件进行了后续研究。在反相液相色谱法中，有很多变量影响色谱柱的再平衡。等度液相色谱法中，色谱运行结束时不存在平衡时间的问题，但改变溶剂组成后，可能需要相当长的时间平衡色谱柱。梯度液相色谱法中，洗脱剂的组成、反相液相色谱柱填料的键合密度、仪器的设计（特别是梯度延迟体积或滞后体积）、流速、是否使用键合相添加剂以润湿键合相、溶质的类型（离子、离子化或中性）和冲洗时间，这些都对色谱柱的再平衡产生影响。

第二，延迟体积是溶剂混合点到柱头的总体积，仪器梯度延迟体积在实际分析中有重要意义。对于高压混合HPLC而言，混合三通、混合器（如果存在的话）、脉冲阻尼器、压力传感器，所有的连接管道及进样装置（包括进样环或旁路体积）和保护柱，延迟体积相当可观。对于低压梯度系统，比例阀、进口和出口止回阀、泵活塞室以及各种管道，增加了更多的梯度延迟。在实际梯度到达色谱柱前，有许多溶剂冲洗出来，但由于延迟量本身与色谱柱的再平衡时间没有关系，因此，这部分溶剂的体积必须从色谱柱洗脱液的总体积中减去。最近，新的UHPLC通过大幅度降低梯度延迟体积及柱外体积，解决了这些问题。

观点二：所有的C18（L1）柱都是相同的。

对于HPLC色谱柱的调查结果显示，到目前为止，C18（十八烷基硅烷键合硅胶）是目前最受欢迎的色谱柱填料［3］。由于高效液相色谱最早的使用者是制药企业，而美国药典委员会不想支持任何特定的高效液相色谱柱制造商，因此开发了一个可以描述新药申请提交时包含各种类型键合柱填料的通用的分类系统。该系统将高效液相色谱柱填料命名为“L”；因为大多数送审记录中使用的是C18，因此将C18命名为“L1”。随着其他键合柱填料的问世，系统为它们分配了各自的“L”编号，如C8（L7），CN（L10），苯基（L11）等等。系统将每一个送审记录中提交的C18柱都命名为L1。然而，色谱柱来自不同的制造商，由不同的二氧化硅和不同的硅烷化试剂经不同的合成路线生产，具有不同的色谱行为，因此彼此之间不能相互替代。随着超过800种不同的L1柱流通入市场，人们发现该分类系统存在不足。虽然已有许多关于色谱柱的分类方法，如疏水减法模式中对反相柱进行的更详细的分类，但就目前而言，“L”分类法仍在广泛使用，因此，一些并不真正了解情况的液相 使用者仍然相信“所有C18柱都是相同的”。然而，我们的观点是：并非所有C18柱（L1）或其他反相柱都是相同的。

［1］Schellinger AP，Stoll DR，Carr PW.High－speed gradient elution reversed－phase liquid chromatography of bases in buffered eluents.Part I.Retention repeatability and column re－equilibration［J］.J Chromatogr A，2008，1192（1）：41－53.

［2］Schellinger AP，Stoll DR，Carr PW.High speed gradientelution reversed phase liquid chromatography of bases in buffered eluents.Part II.Full equilibrium［J］.JChromatogr A，2008，1192（1）：54－61.

［3］Majors RE.Advanced Topics in Solid－Phase Extraction：Chemistries［J］.LCGCNorth Am，2007，25（1）：31－39.

R927.1

A

2095－5375（2014）12－0726－002

选自：Majors RE.The Top10 HPLC and uHPLC Column Myths［J］.LCGC Asia Pacific，2013，16（4）：26－30.

李奕婧，女，研究方向：药品检验，E－mail：liyijing2013＠163.com

程春雷，男，博士研究生，研究方向：药理学，Tel：0531－81216511，E－mail：chengchunl2011＠126.com