固有心脏干细胞与心肌再生的研究进展

曹桎铭综述，石 蓓审校

0 引 言

既往研究认为心脏是一个终末分化器官。2003年Beltrami等［1］首次在成年大鼠心脏内发现了一类具有再生能力的心脏干细胞(cardiac stem cell，CSC)，之后许多研究也证实了这类细胞的存在［2-4］。最近Bergmann等［5］报道了正常成人心脏心肌细胞平均每年更新1%，约40%的心肌是由出生后新生的心肌细胞组成。这些证据推翻了心脏缺乏自我更新潜能的传统观点，为细胞再生治疗翻开一页崭新篇章。

目前已在大鼠［1］、小鼠［2］、猪［6］、犬［7］、和人［8］的心脏均发现CSC的存在。CSC是未分化细胞，部分表达心脏早期转录因子(Nkx2.5、MEF2、GATA4)［9］，其主要存储于心肌内干细胞小生境中，以对称和非对称方式分裂，具有自我更新和定向分化能力［8，10］，由于其自体来源，因此在心血管治疗方面比其他类型成体干细胞更具优势。根据CSC生物学特性及表面标志物，将其分为几种类型:c-kit+细胞、Sca1-1+细胞、侧群细胞、心球或心球衍生细胞、心耳干细胞、Islet1+、心外膜衍生细胞等。

1 CSC群

1.1 c-kit+CSC c-kit+CSC是目前发现最早、研究最深入的一类CSC。2003年Beltrami等［1］首次在成年大鼠心脏发现并分离出c-kit+Lin-细胞，发现其具有干细胞的特性，即自我更新、克隆性和多向分化能力;能特异分化为心肌细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞3种主要心系细胞类型，并在体内显示了心肌梗死后的心肌再生潜能。其后许多研究也得到了相似的结果。

目前发现c-kit+CSC包括2种不同亚群:肌源性(mCSC)和血管源性(vCSC)［11］。前者主要表达c-kit，定居于成熟心肌细胞间的肌细胞小生境中，主要分化为心肌细胞，后者表达c-kit和内皮细胞标志物 (kinase insert domain-containing receptor，KDR)，存储于血管壁的血管小生境中，主要分化为内皮细胞和血管平滑肌细胞。体外培养发现2种CSC均能特异分化为心肌细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞，但mCSC分化为肌细胞数是vCSC的6倍，vCSC分化为平滑肌细胞数是mCSC的6倍，内皮细胞数是mCSC的5倍［8］。c-kit+CSC在心房和心尖含量丰富，心房分布高于心室［12］，以静止状态存储于心脏小生境，通过连接蛋白和钙黏素与周围支持细胞形成连接，活化后迁移出小生境更新衰老或损伤心肌［11］。c-kit+CSC活化迁移机制可能与心肌梗死后多种趋化因子分泌增加相关。例如，低氧处理体外培养c-kit+CSC后其SDF-1、CXCR4均高表达，细胞迁移试验发现SDF-1能促进低氧处理CSC的迁移，并且心肌注射该细胞，发现低氧处理组CSC在心肌梗死区募集增多［2］。而在心脏缺血再灌注大鼠的冠脉内注射c-kit+CSC，发现梗死后高表达的趋化因子SDF-1可通过CXCR4受体诱导其跨过冠脉迁移并归巢至损伤区域［13］。

Welt等［7］在犬心肌梗死6周后心肌内注射c-kit+CSC，30周后发现其仍能显著抑制左室重构、改善心功能。这意味着后期给予c-kit+CSC对于慢性心肌缺血也具有远期疗效。Bearzi等［10］体外培养扩增的人c-kit+CSC，以携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)的慢病毒转染CSC后注射入免疫缺陷小鼠或免疫抑制大鼠心脏，发现其可形成EGFP+新生心肌、冠状血管及毛细血管的嵌合体心脏。

虽然目前大多研究都支持了成体c-kit+CSC的心肌再生作用，但也有部分研究得出了相反的结论。Zaruba等［14］将成年小鼠 c-kit+CSC与胎儿小鼠心肌共培养未见心肌分化，移植入正常和梗死后成年小鼠心脏均未见心肌再生。Jesty等［15］发现梗死后成年小鼠c-kit+细胞只能生成血管原细胞，而并不能分化为心肌细胞，从而引发了其对c-kit+细胞具有干性的质疑。这些矛盾的结果还有待进一步研究解决。

1.2 Sca-1+细胞 近年来Sca-1作为干细胞标志与其它干细胞抗原如c-kit、CD34、CD45等一起用于分离某些成体CSC群［16］。而且Sca1+CSC的再生潜能也得到了广泛验证。移植Sca1+CSC可通过旁分泌 VCAM-1［17］、VEGF［18］和向心肌细胞分化机制改善小鼠心肌梗死后心功能。而敲除小鼠sca-1基因可造成心脏原发性收缩和修复功能缺陷，从而影响c-kit+CSC增殖存活能力［19］。这或许提示sca-1是c-kit+CSC活化、增殖和分化的必需因子。

1.3 侧群(side population，SP)细胞 Hierlihy等［20］首次报道了出生后小鼠心肌中存在侧群细胞，并证明了其干细胞样活性和心肌分化潜能。SP细胞表达ABCG2转运蛋白，可将Hoechst33342染料排除胞外。Pfister等［16］利用此特点和 Sca1、CD31等表面抗原等来分离鉴定心脏侧群细胞。Liang等［21］发现心肌梗死后 SDF-1和 CXCR4均上调，诱导心脏SP细胞的Sca1+CD31-亚群迁移至损伤心肌，分化为心肌样细胞和内皮细胞。而通过r-Wnt3a抑制侧群细胞增殖，则可抑制心肌再生，加重心功能损害［22］。这进一步支持了SP细胞在心肌再生中的积极作用。

总之，SP细胞虽已明确的显示了心血管分化潜能，但并未有研究提示其具有干细胞的克隆性和自我更新潜能，因此其特性尚待进一步研究。

1.4 心球和心球衍生细胞(cardiosphere-derived cell，CDC) 从分离心脏组织后培养可形成成簇聚集的细胞团，称为“心球”，心球由多种CSC混合组成，其中 c-kit+细胞居于心球核心，其外环绕CD105+支持细胞及丰富的胶原IV。心球经过传代扩增后可获得细胞单层，称为CDC［3］。心球和CDC均具有突出的克隆性和多向分化潜能［23］，其在体内的作用也得到了广泛研究。Johnston等［6］采用冠脉内注射猪CDC，发现其可促进心肌细胞再生、减少梗死面积、改善血流动力学。Cheng等［24］将超顺磁性微球标记的CDC注射入大鼠心肌，超导磁铁吸引促进CDC归巢至缺血区，可改善心功能。Li等［25］从人心内膜分离出心球细胞，体外培养时发现心球细胞能够自发聚集形成干细胞小生境样微环境，有利于其生长和增殖。心球高表达2种调控干细胞自我更新、分化的转录因子Nanog和Sox2，注射入心肌梗死后SCID小鼠心脏发现心球具有比CDC更高的移植存活率和心功能改善作用。总之，心球和CDC可能成为最有应用潜力的一个CSC亚群，且CDC最近已被应用于一项I期临床试验。

1.5 心耳干细胞 Koninckx等［26］从人体心耳组织中分离出一种ALDH+的CSC群。通过表型及体外分化研究，发现其是一种非骨髓或外周来源的固有心脏干细胞群，具克隆性以及较CDC更高的心肌分化潜能，移植到小型猪梗死模型后可见大量的心肌分化。

2 其他CSC亚群

除了以上几种干细胞外，在心脏中还发现其他CSC亚群的存在。Laugwitz等［27］在乳鼠心脏中分离出一种 Isl1+未分化细胞，其不表达 sca1、c-kit、CD31，与心肌共培养能分化为成熟心肌。但是在人体中，Isl1+细胞仅存在于胎儿心脏，妊娠中期即显著减少，出生后则消失［28］，从而限制了其临床应用潜能。

成年哺乳动物心外膜也存在一种干细胞，称为心外膜衍生细胞(epicardium-derived cell，EPDC)［29-30］。Smart等［29］使用Tβ4预处理EPDC使胚胎心外膜基因wt1再表达，促进EPDC转分化为功能性心肌。但是，EPDC的分化潜能目前仍存争议，Zhou等［30］研究认为小鼠心肌梗死后EPDC并不分化为心肌或内皮细胞，其修复损伤心肌可能是通过旁分泌机制。

3 CSC的来源和作用机制

固有CSC的存在毋庸置疑，但仍有许多问题尚未解答，如来源、体内活化机制、在内稳态和组织修复中的作用等。其中最具争议的是CSC的来源，一种观点认为其形成于胎儿发育时期，出生后仍持续存在于心脏的干细胞小生境中;另一种观点认为心脏外源原始细胞归巢至心脏成为CSC，分化为心系细胞。前者得到许多研究结果的支持。例如，成体Isl+细胞在动物组织器官的分布与胚胎期Isl+细胞分布一致［27，31］，这意味着他们在胎儿心脏发育时期即存在。而支持后者的研究则显示CSC可能源于骨髓源循环祖细胞，他们在内源性刺激下，募集并归巢至心脏发挥生物学作用。异基因心脏或者骨髓移植后移植心脏可出现含宿主细胞的嵌合体，从而提出其心脏外来源的观点［32-33］。Barile等［34］使用EGFP转基因小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cell，BMSC)移植到野生型小鼠，心肌梗死后分离培养CSC，均表达EGFP，说明了这些CSC的骨髓来源。

CSC生物学功能的另一个问题是他们在体内发挥心脏再生潜能的机制。许多文献报道了CSC的心血管分化潜能和旁分泌作用，能够激活抗凋亡、促血管生成信号通路、促细胞存活和改善心功能［1，2，8-10，35］。此外，心脏外源干细胞与 CSC 发挥协同作用也可能是其生物学作用的一个机制。如BMSC的条件培养基能够减少CSC凋亡，促进其迁移和分化［36］。猪心肌缺血后再灌注联合注射人c-kit+CSC和MSC能够提高其治疗效能，减少梗死面积，改善心功能［37］。

4 CSC与心肌再生

目前研究CSC主要有2种方法:①从心脏组织分离培养CSC，再回输体内;②通过药物使CSC原位活化，发挥心肌再生作用。前者存在许多缺点，如其要求行侵入性手术、细胞扩增时间长、体外操作影响细胞表型、给予CSC的理想途径尚不明确、成功植入率较低等。后者因其直接跨过细胞移植、移植后存活、归巢、免疫排斥等问题，而可能更具临床实用性，且已有多个研究结果验证了这种方法的有效性。Zhang等［38］在小型猪心肌梗死后心肌内注射bFGF，发现SDF-1及其受体CXCR4均上调，并促进c-kit+CSC增殖分化，修复梗死心肌，增加血供。Ellison等［39］研究显示IGF-1/HGF在体外能够激活c-kit+CD45-CSC并促进其心肌分化，将其注射至猪缺血再灌注心脏，可原位激活c-kit+CD45-CSC，促进CSC增殖分化以及心肌再生，减少梗死面积。Yaniz-Galende等［40］使用干细胞因子(stem cell factor，SCF)腺病毒注射入大鼠心肌促使其高表达SCF，发现SCF能够促进c-kit+CSC原位募集增殖，修复梗死心脏。以上结果表明使用药物原位激活CSC可达到CSC移植的效果，并且无细胞移植的副作用，使这一方法更具可行性。

5 CSC的临床应用

c-kit+CSC和CDC是当前唯一应用于心脏病细胞治疗临床研究的CSC。一项关于c-kit+CSC安全性、有效性的随机I期临床研究(SCIPIO试验)正在进行［41］。该试验选取心肌梗死伴左室功能不全患者作为试验对象，CABG术中取心脏组织，体外分离培养c-kit+CSC，其中16名患者术后4个月冠状动脉内回输CSC，对照组不予处理。试验期间未发生细胞移植不良反应，细胞注射4个月后，超声检查发现细胞治疗组左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)明显改善，对照组无变化。随访1年后发现细胞治疗组中8名患者LVEF增加明显，7名患者4个月和12个月后行MRI检查梗死面积减少(对照组未行MRI)。

另一项关于CDC的前瞻性的随机I期临床研究(CADUCEUS试验)于近期结束［4］。双中心随机选取心梗后左室功能不全患者，通过心内膜活检收集组织，分离培养CDC，其中17名给予CDCs冠脉内注射，8名行常规治疗作为对照组。注射24 h内未见并发症发生。6个月后比较2组各项指标，行MRI检查显示瘢痕减少，存活心肌、局部收缩力、室壁厚度显著增加，但是心脏超声提示舒张和收缩末期容积以及LVEF并无差异。这些早期临床数据证明了CDC的心肌再生潜能及其短期有效性和安全性。

需要注意的是CADUCEUS试验在双中心随机选取病例，试验证明了心肌再生，而SCIPIO试验是单中心、非随机的选取患者，也并未证明心肌再生，并且其只对细胞治疗组患者随访行MRI检查，而并未检查对照组，这可能造成假阳性结果。因此SCIPIO试验应视为一个试探性的研究。

6 结 语

冠心病作为世界范围内发病率和死亡率均居前列的疾病，传统治疗手段只能控制临床症状，防止心功能恶化，而不能促进受损心肌再生。随着CSC的发现及深入研究，利用CSC修复损伤心肌成为治疗缺血性心脏病的研究热点。通过使用有效因子激活或直接移植CSC，这些细胞能够在体内再生心肌和重建血管。由于CSC能特异性分化为心系细胞、心脏“原住性”、无需归巢等特点，其在心脏病细胞治疗方面具有强大的优势。虽然CSC已被广泛研究，但仍有许多问题尚待解决，如来源、作用机制、远期疗效等。对这些问题的深入探索能够使我们更有效利用CSC潜能，获得最大治疗效果。

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