两种新复合型CYP21A2突变致单纯男性化型21羟化酶缺陷症

王晓黎，张楠，赵玉岩，史晓光，单忠艳

（中国医科大学1.附属第一医院内分泌科，内分泌研究所，辽宁省内分泌疾病重点实验室；2.基础医学院病原生物学教研室，沈阳110001）

两种新复合型CYP21A2突变致单纯男性化型21羟化酶缺陷症

王晓黎1，张楠2，赵玉岩1，史晓光1，单忠艳1

（中国医科大学1.附属第一医院内分泌科，内分泌研究所，辽宁省内分泌疾病重点实验室；2.基础医学院病原生物学教研室，沈阳110001）

目的分析2例单纯男性化型21羟化酶缺陷症（21-OHD）患者的临床表现、实验室检查和遗传学资料。方法通过患者临床表现、实验室检查及影像学资料确诊，对CYP21A2基因直接测序的方法寻找致病突变位点。应用在线蛋白质功能预测软件预测新突变的功能。结果2例患者均为单纯男性化型21OHD，激素测定提示ACTH、醛固酮、睾酮、雄烯二酮等明显高于正常水平；双侧肾上腺增生。基因测序发现，CYP21A2基因在一例为复合型纯和突变（H62L和V69L），另1例为复合型杂合突变（I2g和10InsL）。在国内该两种复合型突变尚未见报道。V69L为中国人中特有的突变，在线蛋白质功能预测软件提示其极有可能损害蛋白质功能。结论在CYP21A2基因上发现的两种复合型杂合性突变可能与单纯男性化型21OHD的发生有关。

21-羟化酶缺陷症；CYP21A2基因；基因突变

先天性肾上腺皮质增生症（congenital adrenal hyperplasia，CAH）最为常见的原因是21-羟化酶缺陷症（21-hydroxylase deficiency，21-OHD）［1］。21-OHD分为经典型和非经典型（noclassical，NC），经典型又包括失盐型（salt-wasting，SW）和单纯男性化型（simple-virilizing，SV）［1］。CYP21A2基因突变可导致不同程度的21-羟化酶的失活，从而使临床表现各异，通常21-羟化酶完全失活会导致SW型，残存不到2%的酶活性会导致SV型，残存10%～75%的酶活性则表现为临床表现轻微的NC型［1］。本文介绍2例表现为严重SV型的女患及其携带的CYP21A2基因突变，其中1例为复合型纯和突变（H62L和V69L），另1例为复合型杂合突变（I2g和10InsL）。两种复合型突变类型在国内均未见报道。

1 材料与方法

1.1 病史摘要

病例1：女，15岁，以“出生时发现外生殖器发育异常，毛发增多、痤疮8年余”为主诉入院。患者于8年前无明显诱因出现毛发增多，表现为唇周少许胡须生长，阴毛生长，四肢及后背部汗毛加重，面部、四肢及躯干部痤疮生长，阴蒂轻微肥厚，肌肉发达，体力佳，智力与周围同龄儿无差异，身高增长快速，高于其他同龄儿，未在意，未系统诊治。3年前无明显诱因出现生长停止，自觉痤疮加重，毛发生长浓密，表现为唇周及下颌部胡须生长浓密，腋毛及阴毛生长浓密，阴毛呈菱形分布，阴蒂生长，变肥大。2年前月经初潮，行经2 d，经血量少，经血颜色正常，此后再无月经来潮，乳房无明显发育，多毛及痤疮逐渐加重。为明确诊治而入院，病来无发热，无头痛、头晕，有怕热、多汗，易烦躁，无恶心、呕吐，无腹痛、腹泻，精神状态良好，饮食及睡眠可，二便正常。既往史：否认高血压、糖尿病、冠心病病史。

查体：体温：36.5动℃，脉搏：80次/min，呼吸：18次/min，血压120/80 mmHg，身高145 cm，体质量50 kg，体重指数23.8 kg/m2，腰围77 cm，臀围87 cm，WHR 0.89。指间距147 cm，上部量69 cm，下部量76 cm。毛发增多，发髻线低，无满月脸及多血质面容，可见喉结，颜面、四肢及躯干部可见皮肤痤疮，毛囊角化，唇周及下颌部胡须生长浓密及腋毛生长浓密，无颈蹼、肘外翻，双乳腺无明显发育。双肺呼吸音清，未闻及啰音，心率80次/min、律齐，未闻及病理性杂音。左侧上臂内侧及双腿内侧可见紫纹，腹软，无压痛，肝脾肋下未触及，双下肢无浮肿，阴毛浓密、呈男性分布，可见阴蒂肥大呈阴茎状，尿道口与阴道口重叠。

病例2：女，26岁，以“闭经多毛约10年，血压升高3年。”主诉入院。患者约10年前青春期开始发育时出现体毛增多，以下颌部、下腹部为主，乳房略发育，未来月经至今。当时身高150 cm，体质量70 kg，约7～8年前身高停止生长，体质量逐渐增加，智力发育正常。曾就诊其他医院，口服达英35人工月经治疗4周期，未来月经，未见乳房发育、毛发脱落、分泌物增多等症状。后自行停药，曾于当地医院口服雌激素及中药治疗，效果不明显。3年前体检时发现血压升高，最高160/100 mmHg，未服药控制血压。今为查明原发性闭经及高血压原因就诊于我院。患者病来无明显诱因偶有心悸症状，可自行缓解，无周期性乏力、软瘫，无面部潮红大汗，无头晕头痛。患者发病来饮食睡眠可，精神状态可，二便正常，体质量无明显改变。既往史：既往体健。否认冠心病、糖尿病等慢性病史，否认乙肝、结核等传染性疾病史，否认药物过敏史。

查体：体温：37.3℃，脉搏：84次/min，呼吸：15次/min，血压：140/90 mmHg。身高1.5 m，体质量80 kg，体重批量数35.56 kg/m2，腰围101 cm，臀围108 cm，WHR 0.94。上部量81 cm、下部量70 cm、指间宽149 cm。面色红润，无痤疮，上额发迹退后不明显呈男性化表现，眼睑无浮肿，唇上及下颌部有胡须分布。颈部及腋下黒棘皮表现，四肢体毛浓密，皮肤有角化毛囊，无通贯掌，无手趾脚趾缺如，无镜像运动，掌指短小。前胸后背可见少量体毛，乳晕周围有体毛分布，腋窝部可见腋毛正常分布，下腹部可见大量粗硬毳毛，无紫纹及瘀斑，腹软，无压痛、反跳痛及肌紧张，肝脾肋下未触及，肝肾区无叩痛，双下肢无水肿。阴毛浓密呈菱形分布。外生殖器发育正常，阴蒂不大。

1.2 检测方法

肝肾功能、血电解质等以全自动生化仪测定；并作口服葡萄糖耐量试验、胰岛素释放试验、2 mg地塞米松抑制试验。LH、FSH、催乳素、雌二醇、孕酮、睾酮、脱氢表雄酮及雄烯二酮采用化学发光法测定，ACTH采用免疫放射法测定。血肾素、血管紧张索、醛固酮（基础和立位激发）、胰岛素及皮质醇等采用放射免疫法测定。

1.3 基因组DNA提取

使用血液基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技北京有限公司）提取基因组DNA，取血液样品300 μL，在样品中加入2.5倍体积的细胞裂解液，颠倒混匀，10 000 r/min离心1 min，弃上清；向沉淀中加入20 μL Proteinase K溶液，200 μL核酸提取液，充分颠倒混匀，56℃放置10 min；加200 μL无水乙醇，充分颠倒混匀并将其加入吸附柱中12 000 r/min离心30 s；向吸附柱中加入500 μL缓冲液12 000 r/min离心30 s，向吸附柱中加入600 μL漂洗液，12 000 r/min离心30 s，滴加40 μL双蒸水溶解DNA。检测基因缺失：所需引物CYP21A2-1/CYP21A2-2（表1），反应条件为：95℃预变性2.5 min，95℃变性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸5 min。用TaqⅠ限制性内切酶（购自宝生物工程大连有限公司）消化［2］，反应体系及条件：TaqⅠ1 μL，10×TaqⅠBasal Buffer 2 μL，0.1%BSA 2 μL，PCR产物10 μL，加双蒸水至20 μL。65℃水浴3 h。正常个体会发现210 bp和187 bp带强度相等，如果缺失单条CYP21A2基因，210 bp较187 bp带强度下降，如果两条基因都缺失则只能检测到187 bp条带。PCR反应体系及条件：引物根据GeneBankCYP21A2基因序列设计特异性引物分别为P1P2，P3P4（表1）扩增两个相互重叠的CYP21A2基因片段（引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成）。反应液的构成：dNTP 0.2mmol/L，10 x Buffer 2.5 μL，引物各40 pmol/L，8 UTaQ聚合酶（宝生物工程大连有限公司），模板200 ng，加双蒸水至50 μL。以P1、P2为引物PCR反应条件为：95℃预变性2.5 min，95℃变性1 min，65℃退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸5 min。以P3、P4为引物PCR反应条件为：95℃预变性2.5 min，95℃变性1 min，59℃退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸5 min。

1.4 测序

对PCR产物进行纯化（天根生化科技北京有限公司琼脂糖凝胶回收试剂盒）再由北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。测序引物为PCR扩增引物P1～P4以及测序引物P5、P6（表1）。

表1 PCR引物及其碱基序列Tab.1 Primer sequences used in PCR

1.5 在线软件预测突变的功能

应用了5个在线蛋白质预测软件：PolyPhen，SIFT，Align-GVGD，SNAP和PMut（http：//www. gen2phen.org/wiki/protein-level-predictions-1-pathogenic-or-not-predictors#Programs）对突变位点进行分析，各软件具体功能及结果判断方式请参见表3中网址内容。

2 结果

2.1 实验室检查

病例1：辅助检查见表2。双侧肾上腺CT：双侧肾上腺弥漫性增粗，考虑肾上腺增生（图1A）。子宫附件彩超：子宫前倾位，宫体大小约3.4 cm×2.6 cm×1.9 cm，子宫发育略小。染色体核型分析：46，XX。

病例2：辅助检查见表2。大小地塞米松试验示皮质醇分泌明显抑制，抑制率均大于50%。染色体核型分析：46，XX。肾上腺CT：双侧肾上腺弥漫性增粗（图1B）。垂体MRI未见异常。

图1 病例肾上腺平扫CT和增强CTFig.1 Adrenal unenhanced and enhanced computed tomography

2.2CYP21A2基因分析及测序结果

通过应用TaqⅠ限制性内切酶消化基因片段，两名患者均未发现CYP21A2基因缺失。CYP21A2基因在病例1为复合型纯和突变（图2，H62L和V69L），病例2为复合型杂合突变（图3，I2g和10InsL）。在国内该2种复合型突变尚未见报道。V69L突变在国外尚未见报道。

图2 病例1的CYP21A2基因测序结果与正常人对比Fig.2 Direct sequencing result of CYP21A2of case 1

2.3 在线蛋白质预测软件结果

应用5个蛋白质预测软件（PolyPhen，SIFT，Align-GVGD，SNAP和PMut）预测CYP21A2基因的新发突变V69L，其中2个软件提示该突变很有可能影响到该基因编码的蛋白质的功能，另外3个则提示可能性较小。同时分析了已知致病突变H62L作为对照。结果见表3。

表2 2例患者的实验室检查结果Tab.2 Laboratory examination results of the two cases

3 讨论

21-OHD的SW型因21-羟化酶活性完全缺乏，病情较重，多在幼年夭折，而SV型的21-羟化酶残存部分活性，病情较轻，患者就诊时间较晚，本文介绍的2例SV型21-OHD即为最近在我院内分泌科就诊的年轻女性，临床表现和实验室检查支持该诊断，进一步行基因学诊断明确了突变类型，2例均为复合型突变，复合突变的组合类型尚未见报道，其中H62L在国内尚未见报道，V69L仅在中国人中曾见报道。外显子1中H62残基位于β-1平面区域，CYP21A2编码蛋白的54-63号氨基酸构成了一个重要的功能性疏水区域，可防止蛋白质残端通过内质网［3］，当组氨酸被亮氨酸取代后，蛋白质的透过度增加，从而会影响到酶的功能。H62L突变可以使21-羟化酶活性降低至21%～44%（分别用孕酮和17OHP为底物时）［4］，通常会导致NC型21-OHD，当有其他突变合并存在时，会使21-羟化酶活性进一步下降至2%～4%，导致SV型21-OHD［4］。国外曾报道H62L与多种突变复合存在时会导致SV型21-OHD［5］，国内尚未见报道过在21-OHD患者中发现H62L突变，H62L与其它突变同时存在的情况也是首次发现。病例1的位于外显子2的另一个突变V69L在国外尚未见报道，HGMD数据库中尚无资料（www.hgmd. org），但在国内协和医院曾提及在NC型21-OHD患者中发现此突变（尚未正式发表，来源于2012年中华医学会第十一次全国内分泌学术会议），可能是中国人特有的突变。通过在线预测软件分析（in silicoanalysis），polyphen软件预测得分是0.971，很可能会影响蛋白质的功能，但SIFT软件预测为可耐受，有研究表明此两种预测软件对于类固醇代谢相关基因中的突变功能预测比较一致，但polyphen更优于SIFT［6］。此突变需要进一步体外研究证实其功能。病例2中的I2g剪切性突变是最为常见的8个21-OHD致病突变之一（P30L，I2g，E3Δ 8bp，I172N，E6，V281L，Q318X，R356W）［1］，在各型21-OHD中都可存在，纯合性突变与SW型相关，杂合性突变则与SV型和NC型相关。国内几个中心对21-OHD患者的基因学分析显示I2g突变在国人中发生的几率可排在第1～2位［7～9］。该患者同时存在的外显子1的10InsL经研究证实为多态性，对基因的功能影响较小［10］。本研究通过对两名临床诊断为SV

图3 病例2的CYP21A2基因测序结果与正常人对比Fig.3 Direct sequencing result of CYP21A2of case 2

表3 在线蛋白质预测软件结果Tab.3 Predictive results of online protein function analyze software

型21-OHD患者进行CYP21A2基因测序，发现了两种新的复合型突变，对于汉族人21-OHD的基因学病因做出了补充。

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（编辑 裘孝琦）

Two NovelComplex Mutations of CYP21A2Gene Causing Simple Virilizing 21-hydroxylase Deficiency

WANGXiao-li1，ZHANGNan2，ZHAOYu-yan1，SHIXiao-guang1，SHANZhong-yan1
（1.Key Laboratory of Endocrine Diseases of Liaoning Province，Department of Endocrinology and Metabolism，Institute of Endocrinology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Microbiology and Parasitology，College of Basic Medical Science，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the clinical manifestations，laboratory findings and genetic characteristics of two cases with simple virilizing（SV）21-hydroxylase（21OHD）.MethodsClinicalmanifestations and laboratory data were obtained.The promoterand coding areas ofCYP21A2gene were directly sequenced.In silico analysis were used to predict the function of mutations.ResultsTwo patients presented severe virilism.The laboratory examinations showed that plasma ACTH，aldosterone，androstendione and testosterone were significantly increased compared with normal individuals.VCT scan showed hyperplasia ofbilateraladrenal.Directsequencing ofCYP21A2gene showed two complex mutations-H62L/V69LandI2g/10InsL，which were not reported previously.In silico analysis（Polyphen）showed the novel mutationV69Lcould probably damage the function ofCYP21A2 protein.ConclusionThe combined mutations，H62L/V69LandI2g/10InsL，could be associated with SV type 21-OHDphenotype.

21-hydroxylase deficiency；CYP21A2gene；gene mutation

R322.5

A

0258-4646（2014）05-0396-06

国家自然科学基金（81370189）；国家自然科学基金青年基金（81200653）

王晓黎（1980-），男，副教授，博士. E-mail：wlittlepear@163.com

2014-01-16

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