miR⁃24⁃2对人骨肉瘤细胞系U⁃2OS体外增殖能力的影响

梁德勇，陈升，王野，富伟能

（中国医科大学1.附属第一医院骨科；2.基础医学院医学遗传学教研室，沈阳110001）

miR⁃24⁃2对人骨肉瘤细胞系U⁃2OS体外增殖能力的影响

梁德勇1，陈升2，王野2，富伟能2

（中国医科大学1.附属第一医院骨科；2.基础医学院医学遗传学教研室，沈阳110001）

目的探讨miR-24-2对人骨肉瘤细胞系U-2OS体外增殖能力的影响。方法用脂质体法将miR-24-2模拟物转染入人骨肉瘤细胞系U-2OS。将U-2OS细胞分为miR-24-2模拟物转染组、miR-24-2抑制剂转染组、阴性对照组和正常对照组4组。转染后采用实时定量RT-PCR检测各组细胞miR-24-2的表达水平，采用MTT法检测各组细胞的增殖情况。结果与阴性对照组和正常对照组比较，miR-24-2模拟物转染组细胞增殖能力显著下降，而miR-24-2抑制剂转染组细胞增殖能力显著增强。结论miR-24-2能够抑制人骨肉瘤细胞系U-2OS的体外增殖能力，可望成为骨肉瘤治疗的分子标志物。

miR-24-2；骨肉瘤；转染；增殖

骨肉瘤是常见非造血系统来源的原发性恶性骨肿瘤之一，易发于骨生长迅速阶段。因此，大部分患者的年龄介于12～25岁之间，研究表明青春期骨生长与骨肉瘤的发生发展具有一定的相关性［1，2］。骨肉瘤恶性程度高，易发生远处转移。常规治疗骨肉瘤的效果不佳，且术后易复发、转移率高，患者的预后和生存率极差。

包括microRNA在内的非编码小分子单链RNA在生物的生长发育、细胞增殖、分化和凋亡等过程中发挥重要作用［3］。microRNA异常表达水平与肿瘤细胞的发生、发展、增殖、侵袭和转移等密切相关。microRNA在血液、尿液和乳汁等12种体液中稳定表达，是极具价值的疾病诊断和治疗的分子靶标［4］。

miR-24-2在人体多种组织中表达，具有调节细胞生长、增殖和凋亡的功能。研究表明，miR-24-2在不同肿瘤细胞中发挥的作用不同［5］。因此，研究miR-24-2在某个特定肿瘤中的表达水平及其作用对肿瘤发生机制和肿瘤的基因治疗方面都具有重要的意义。目前，有关miR-24-2在骨肉瘤中的作用尚未见相关报道。因此，本研究拟检测miR-24-2对人骨肉瘤细胞系U-2OS体外增殖能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

RPMI1640培养基、热灭活马血清（Hyclone公司），四季青胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司），LipofectamineTM2000转染试剂、DMSO（Invitrogen公司），Trizol、miRNA反转录试剂盒、实时定量RT-PCR试剂盒（TaKaRa公司），MTT检测细胞增殖试剂盒（凯基公司）。microRNA相关短片段由上海吉玛公司合成。人骨肉瘤细胞株U-2OS购自上海中国科学院细胞库。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：在含10%热灭活马血清和5%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，于37℃、5%CO2培养箱中培养人骨肉瘤细胞株U-2OS。

1.2.2 细胞转染：取对数生长期U-2OS细胞，用LipofectamineTM2000转染试剂按照说明书将miR-24-2（5′-UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG-3′）、miR-24-2抑制剂（5′-CUGUUCCUGCUGAACUGAGCCA-3′）、microRNA阴性对照（5′-UUCUCCGAACGUGUCACG UTT-3′）转染至U-2OS细胞中，分别设定为miR-24-2模拟物转染组、miR-24-2抑制剂转染组、阴性对照组，未转染组作为空白对照。各短片段的使用量均为20 nmol/L。

1.2.3 实时定量RT-PCR检测细胞miR-24-2的表达：转染后48 h收集各组细胞，按照Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA，用分光光度计定量检测。按照One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit和SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明书进行miRNA qRT-PCR反应，在ABI 7500 Real Time PCR仪上进行反应及结果分析。miR-24-2引物序列：上游：5′-TGGCTCAGTTCAGCAGGAACAG-3′，下游：5′-CGAATTCTAGAGCTCGAGGCAGGCGACATGGC TGGCTAGTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCAC TAGTCC（T）25VN-3′。U6引物：上游：5′-CTCGCTT CGGCAGCACA-3′，下游：5′-AACGCTTCACGAATTT GCGT-3′。

1.2.4 细胞增殖检测：转染后，将2×103～3×103个细胞接种于96孔板，每孔加入100 μL培养基，37℃、5%CO2培养箱中继续培养。每组设5个复孔，每板另设单孔。转染后，分别培养24、48、72、96 h。每孔加入50 μL MTT，在37℃、5%CO2培养箱中继续培养4 h。弃掉培养基和MTT，每孔加入150 μL DMSO进行显色反应。选择490 nm波长，在酶标仪上测定各孔吸光度值（OD value），记录结果，以时间为横坐标，平均吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。分别观察转染后各组细胞连续4 d的增殖情况。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 转染后各组细胞miR-24-2的表达水平

如图1所示：miR-24-2模拟物转染组miR-24-2表达含量与其他各组相比显著上升，差异有统计学意义（P＜0.05）。而miR-24-2抑制剂转染组miR-24-2表达含量与其他各组相比显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。阴性对照组与空白对照组比较，miRNA-24-2表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 转染后各组细胞miRNA⁃24⁃2表达水平（n=3）Fig.1 miR⁃24⁃2 expression levels in different groups（n=3）

2.2 转染后各组细胞的增殖情况

MTT检测结果如图2所示：与阴性对照组和正常对照组相比，miR-24-2模拟物转染组细胞增殖能力显著降低，miR-24-2抑制剂转染组细胞增殖能力则显著增高（P＜0.05）。

图2 miR⁃24⁃2对人骨肉瘤细胞U⁃2OS增殖的影响Fig.2 Effects of miR⁃24⁃2 on proliferation of U⁃2OS cells

3 讨论

细胞增殖和凋亡的调控机制非常复杂。除原癌基因和抑癌基因外，microRNA在肿瘤初步增殖和凋亡过程中发挥重要调节作用。第一个与增殖相关的microRNA基因是bantam，该基因通过抑制其靶基因hid促进细胞增殖［6，7］。Van Rooij等［8］研究发现在心肌肥大过程中miR-24-2表达上调，且miR-24-2过表达可诱导心肌肥大的发生。提示miR-24-2具有促进心肌细胞生长的作用。目前，人们已发现miR-24-2的多个靶基因，例如FAF1、DHFR、E2F2、MYC等，这些靶基因的编码产物均为细胞周期调控因子［9～11］。研究报道，相关microRNA在骨肉瘤的发生发展中起重要作用，并影响骨肉瘤的生物学行为［12，13］。

前期研究认为，miR-24-2具有抑制骨肉瘤细胞U-2OS的克隆形成能力［14］。在本研究中，通过体外转染实验获得miR-24-2过表达和低表达的骨肉瘤细胞，MTT检测结果表明过表达miR-24-2使U-2OS细胞增殖能力显著下降，而低表达miR-24-2使U-2OS细胞增殖能力显著增加，上述结果提示miR-24-2在骨肉瘤中可能发挥着肿瘤抑制基因的作用，可能成为未来骨肉瘤诊断、治疗和预后判定的一个重要的分子靶点。miR-24-2抑制骨肉瘤细胞增殖的分子机制及其临床意义有待进一步探讨。

［1］Cotterill SJ，Wright CM，Pearce MS，et al.Stature of young people with malignant bone tumors［J］.Pediatr Blood Cancer，2004，42（1）：59-63.

［2］Lam CG，Roter DL，Cohen KJ.Survey of quality，readability，and social reach of websites on osteosarcoma in adolescents［J］.Patient Educ Couns，2013，90（1）：82-87.

［3］Weber JA，Baxter DH，Zhang S，et al.The microRNA spectrum in 12 body fluids［J］.Clin Chem，2010，56（11）：1733-1741.

［4］Zhang B，Stellwag EJ，Pan X.Large-scale genome analysis reveals unique features of microRNAs［J］.Gene，2009，443（1-2）：100-109.

［5］Cheng AM，Byrom MW，Shelton J，et al.Antisense inhibition of human miRNAs and indications for an involvement of miRNA in cell growth and apoptosis［J］.Nucleic Acids Res，2005，33（4）：1290.

［6］Hipfner DR，Weigmann K，Cohen SM.The bantam gene regulates Drosophila growth［J］.Genetics，2002，161（4）：1527-1537.

［7］Brennecke J，Hipfner DR，Stark A，et al.Bantam encodes a developmenttlly regulated microRNA that controls cell proliferation and regulates the proapoptotic gene hid in Drosophila［J］.Cell，2003，113（1）：25-36.

［8］Van Rooij E，Sutherland LB，Liu N，et al.A signature pattern of stress-responsive microRNAs that can evoke cardiac hypertrophy and heart failure［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（48）：18255.

［9］Mishra PJ，Humeniuk R，Mishra PJ，et al.A miR-24 microRNA binding-site polymorphism in dihydrofolate reductase gene leads to methotrexate resistance［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（33）：13513-13518.

［10］Lal A，Navarro F，Maher CA，et al.miR-24 inhibits cell proliferation by targeting E2F2，MYC，and other cell-cycle genes via binding to"seedless"3＇UTR microRNA recognition elements［J］.Mol Cell，2009，35（5）：610-625.

［11］Qin W，Shi Y，Zhao B，et al.miR-24 regulates apoptosis by targeting the open reading frame（ORF）region of FAF1 in cancer cells［J］.PLoS One，2010，5（2）：e9429.

［12］Wu Z，Yang S，Weng X，et al.MicroRNA-21 is involved in osteosarcoma cell invasion and migration［J］.Med Oncol，2011，28（4）：1469-1474.

［13］Song B，Wang Y，Xi Y，et al.Mechanism of chemoresistance mediated by miR-140 in human osteosarcoma and colon cancer cells［J］.Oncogene，2009，28（46）：4065-4074.

［14］梁德勇，陈升，王野，等.microRNA-24-2对人骨肉瘤细胞系U-2OS克隆形成能力的影响［J］.解剖科学进展，2014，（01）：9-11.

（编辑 王又冬）

EffectofmiR-24-2 on Proliferation ofU-2OS CellLine

LIANGDe-yong1，CHENSheng2，WANGYe2，FUWei-neng2
（1.Department of Oosteology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Departmant of Medical Genetics，College of Basic Medical Science，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo explore the effectofmiR-24-2 on the in vitro proliferation ofU-2OS cells.MethodsU-2OS cells were randomly allocated into 4 groups：miR-24-2 mimic group，miR-24-2 inhibitor group，negative control group，and normal control group.MicroRNAs were transfected into U-2OS cellsusing Lipofectamine™2000.miR-24-2 expression leveland the proliferation ofU-2OS cellsaftertransfection were detected by real -time quantitative RT-PCR（RT-qPCR）and MTT proliferation assays，respectively.ResultsRT-qPCR results showed thatmiR-24-2 levelwassignificantly higher in the miR-24-2 mimic group and lower in the miR-24-2 inhibitor group than those in the controls，indicating the successive transfection.MTT proliferation assay results proved that the cell viability was significantly lower in the U-2OS cells transfected with miR-24-2 mimic and higherin inhibitorgroups compared to the control.ConclusionMiR-24-2 inhibits growth ofthe U-2OS cells，which could be a potentialbiomarker in the treatmentofosteosarcoma.

miR-24-2；osteosarcoma；transfection；proliferation

R738.7

A

0258-4646（2014）05-0393-03

国家自然科学基金（81172577）；辽宁省教育厅高校科研计划（L2010595）

梁德勇（1967-），男，副教授，本科.

陈升，E-mail：787140302@qq.com

2014-03-10

网络出版时间：