普萘洛尔治疗肿瘤可行性分析

桑 桑 吕方启

(泰山医学院附属医院小儿外科，山东 泰安 271000)

自从法国Bordeaux儿童医院的医师Léauté-Labrèze等于2008年在《新英格兰医学》上首次介绍普萘洛尔(propranolol，心得安)用于血管瘤的治疗后[1]，开创了普萘洛尔治疗血管瘤的先河。因血管瘤的内皮细胞与肿瘤血管的内皮细胞有同样的生成机制，本文就普萘洛尔治疗血管瘤的机制推断出普萘洛尔治疗肿瘤的可行性。

背景：血管瘤的主要发生机制为促进血管形成因子及抑制血管形成因子的水平失衡。促进血管形成的因子中最主要的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)，机制为促进血管内皮细胞增殖活跃。另外，VEGF与bFGF在血管瘤消退期的表达显著减少。然而，肿瘤的形成主要是肿瘤血管的异常增生，肿瘤的血管生成处于持续、失控的生长状态，管腔不规则，基底膜薄且无周围细胞或者平滑肌细胞包绕，不接受神经内分泌系统的精细调节。现已证实，各种实体肿瘤血管生成过程中涉及诸多影响血管内皮细胞生长的内、外源性细胞因子及受体，其中血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(VEGFR)在肿瘤的血管形成和内皮细胞存活过程中发挥关键作用。普萘洛尔作用机制：(1)抑制一氧化氮(NO)合成与释放，从而导致瘤体血管收缩，此在临床表现为用药后短时间内瘤体颜色变浅，触诊质地变软。(2)下调VEGF与bFGF的表达而抑制血管生成，并表现为用药中期血管瘤的生长阻滞。(3)介导并加速毛细血管内皮细胞凋亡从而导致用药后期瘤体消退。另外，普萘洛尔抑制间质金属蛋白酶-9(MMP-9)以及人脑微血管内皮细胞(HB-MEC)的表达也可能潜在地抑制了血管瘤的血管生成。由此可以推定普萘洛尔可以作为遏制肿瘤细胞生长的靶向药物。

假设理论/想法：2008年，法国Bordeaux儿童医院的Léauté-Labrèze等[1]发现，在使用普萘洛尔治疗1例伴肥厚梗阻性心肌病和1例心输出量增加患儿合并面部血管瘤时，意外发现应用普萘洛尔后血管瘤体表面颜色变浅(深红变为 红)，质地变软，范围缩小。在征得患儿父母同意后，另外9例颌面部血管瘤患儿使用了普萘洛尔，用药后24h患者血管瘤颜色均变浅，质地变软，肿瘤体积不同程度缩小。除个别病例出现血压偏低外，未出现严重不良反应。自此以后，国内外有大量关于普萘洛尔治疗血管瘤的报告，2年间普萘洛尔治疗血管瘤从偶然发现到迅速成为部分血管瘤治疗的一线药物。

1 普萘洛尔治疗血管瘤的作用机制

普萘洛尔治疗IH的机制迄今尚未完全明确。目前，比较公认的[1-4]治疗机制认为可能是以下3个方面共同作用的结果：(1)抑制一氧化氮(NO)合成与释放，从而导致瘤体血管收缩，此在临床上表现为用药后短时间内瘤体颜色变浅，触诊质地变软。(2)下调VEGF与bFGF的表达而抑制血管生成，并表现为用药中期IH的生长阻滞(growth retardation)。(3)介导并加速毛细血管内皮细胞凋亡从而导致用药后期瘤体消退。

1.1临床验证

实践证实普萘洛尔治疗血管瘤起效快，疗效确切，个体差异小，不良反应少。其治疗机制可能为多因素作用的结果，对血管瘤早期、中期和长期的作用可能有3个不同机制:在应用早期，通过降低NO释放，使血管收缩；中期疗效机制可能与阻断血管形成的相关信号通路有关；长期疗效机制是通过诱导血管内皮细胞凋亡，促进肿瘤消退[5]。

1.2对局部血管的收缩作用

在治疗前期，如用药24h后瘤体颜色变浅，触诊质地变软，可能系血管收缩的原因。通过降低NO释放收缩周围血管，减小瘤体体积，该过程较为迅速[6]。

1.3抑制血管生成因子(VEGF和bFGF)表达

血管瘤的形成是血管生成无节制或血管生成因子和抑制因子作用不平衡造成的。VEGF和bFGF在血管瘤形成中具有重要作用[7]。VEGF是一种糖基化分泌性多肽因子，亦称血管渗透因子，可使内皮细胞增殖、迁移，提高血管通透性，促进新生血管和基质细胞生长。bFGF是一种强烈的内皮细胞和管壁结缔组织促生长因子，能促进内皮细胞迁移进入细胞外基质，形成毛细血管样组织，诱导VEGF分泌。血管瘤标本中VEGF mRNA和bFGF mRNA在增殖期的表达水平高于消退期[8]。通过比较增殖期血管瘤患者、血管畸形和正常婴幼儿尿中bFGF时发现增殖期血管瘤患者尿中bFGF增高，而血管畸形和正常婴幼儿尿中bFGF正常[9]。在小鼠胎盘激活β肾上腺受体可刺激VEGF形成，普萘洛尔可通过下调VEGF降低新生小鼠低氧诱导视网膜病变[10]。

1.4加速血管内皮细胞凋亡

细胞凋亡(apoptosis)是引起血管瘤自行消退的重要原因之一，血管瘤内皮细胞凋亡在增殖期很低，而消退期细胞凋亡数目可达增殖期的5倍多，从而促进瘤体消退[11,12]。

1.5抑制内皮细胞血管生成及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)的分泌

细胞外基质(extracellular matrix,ECM)是抑制血管瘤生长的天然屏障，其降解是血管生成中必不可少的环节。ECM降解接受MMP及其活性抑制剂--金属蛋白酶组织抑制剂的共同调节。MMP家族能降解细胞外基质，引起血管瘤的增殖，其中MMP-9在增殖期血管瘤内皮细胞表达明显高于消退期及正常组织，在血管瘤生成尤其在降解基底膜过程中发挥巨大作用[13]，通过抑制MMP-9分泌可以抑制内皮细胞迁移和新生血管形成，减少人脑微血管内皮细胞血管形成[14]。在体外培养的高表达β2-肾上腺素受体的人大脑微血管内皮细胞中加入普萘洛尔后，体外培养的血管生成大幅度减少，显著降低MMP-9分泌，提示普萘洛尔可以抑制人脑血管内皮细胞生成和MMP-9分泌，从而抑制血管瘤生长[15]。

1.6作用G-蛋白信号等通路

β-肾上腺素受体是一种G蛋白偶联受体(GPCR)，研究发现肾上腺素及普奈洛尔对间充质干细胞的分化能力有影响，在氧化应激时，肾上腺素通过作用于β2受体合成谷胱甘肽，选择性保护间充质干细胞的分化能力。普奈洛尔对婴幼儿血管瘤的作用可能就是阻滞了这一保护作用[16]。普萘洛尔抑制血管生成不仅包括对β-肾上腺素受体信号的抑制，也抑制了VEGFR-2通路。研究表明，普萘洛尔通过调节细胞周期依赖激酶(CDK)和CDK的细胞周期蛋白激酶抑制剂，引起内皮细胞停滞在G1细胞周期，抑制VEGF受体-2(VEGFR-2)信号通路，抑制MMP-2分泌[17]。

2 肿瘤的发生机制

血管生成在人类恶性肿瘤的增殖、侵袭和转移过程中发挥至关重要的作用。肿瘤血管生成是所有实体肿瘤的共同特征，是实体肿瘤生长和转移必须依赖的病理学基础。现已证实，不同实体肿瘤血管内皮细胞所表达的生长因子及其受体均有共性，肿瘤的血管生成处于持续、失控的生长状态，管腔不规则，基底膜薄且无基质细胞或者平滑肌细胞包绕，不接受神经内分泌系统的精细调节。现已证实，各种实体肿瘤血管生成过程中涉及诸多影响血管内皮细胞生长的内、外源性细胞因子及受体，其中VEGF及其受体(VEGFR)在肿瘤的血管形成和内皮细胞存活过程中发挥关键作用。当肿瘤生长>2 mm时，因缺氧刺激VEGF表达上调，与内皮细胞上的酪氨酸激酶型受体--VEGFR结合自身发生磷酸化，激活内皮细胞分泌多种蛋白酶以降解基底膜和细胞外基质，使内皮细胞游离并向VEGF等刺激因子聚集部位迁移。与此同时，通过激活内皮细胞内的信号转导途径，促进血管内皮细胞增殖，形成条索状血管雏形。通过刺激成纤维细胞外基质，并经血管重塑，形成肿瘤新生血管。因此抑制肿瘤血管增殖、阻断上述生长因子与其受体的结合成为抑制肿瘤血管生成的重要举措。通过普萘洛尔治疗血管瘤的机制可推断出普萘洛尔也可以抑制肿瘤的血管异常增生，并且能够成为治疗肿瘤的靶向药物。

假说验证：如果普萘洛尔可以治疗异常的血管瘤增生，推定其可以作为治疗肿瘤的药物，我们通过实验可以验证。

2.1神经母细胞瘤大鼠模型制备

(1)材料：选用SPF(specific-pathogen free)级BALB/C-NU裸鼠。鼠龄：4周。体重：18～22 g。先在实验室饲养1～2 d，温度25 ℃±2 ℃、湿度75%RH，笼盒每周高压灭菌一次(121 ℃，1.034×105 Pa，灭菌20 min)。饮用水经高压灭菌(121 ℃，1.034×105 Pa，灭菌20 min)，标准饲料经Co-60照射灭菌，供裸鼠自由摄食，每周添加2次饮用水和饲料。垫料为碎玉米芯经高压灭菌(121 ℃，1.034×105 Pa，灭菌20 min)，每周更换2次垫料。(2)个性化人神经母细胞瘤组织块种植方法：从手术切除的人瘤体新鲜标本中切取 直径约1 cm左右组织块，保存于加入青一链霉素双抗的RPMI-1640培养液中，在标本获取6h之内进行种植。超净T作台内以RPMI-1640培养液反复冲洗神经母细胞瘤组织块，用剪刀将组织块修剪成直径约2mm的小块，用25号接种针将其种植于BALBC裸鼠背部皮下组织内，每例人新鲜标本均移植入5只裸鼠体内，整个肿瘤组织块的制备和种植在无菌条件下进行，成瘤者为荷瘤模型。

2.2普萘洛尔效果观察

荷瘤模型分为3组。在无特定病原体(SPF)条件下饲养，种植同一例神经母细胞瘤患者标本组织块的5只裸鼠饲养于同一笼舍之内。每日观察接种部位肿瘤生长情况，待发现肿瘤生长后，A组给与生理盐水、B组给与环磷酰胺、C给与普萘洛尔腹腔注射，每隔一天测1次肿瘤直径，计算肿瘤体积V，V=(D×d)/2，D为肿瘤表面最长径，d为肿瘤表面最短径。2周后处死，①取血清检测尿香草扁桃酸(VMA)、铁蛋白(SF)、乳酸脱氢酶(LDH)、神经元特异性稀醇化酶(NSE)等生化指标测定。②肿瘤血管密度(microvessel density，MVD)的检测：采用链霉素抗生物素蛋白—过氧化物酶连接法(S-P法)检测。将裸鼠移植瘤剥离，HE染色切片。在低倍电镜下扫视整个切片，找到瘤细胞和内皮细胞染色清晰、高血管密度区(热点)，再用中倍镜在热点中计数CD34抗体染色的阳性血管数，取3个热点的平均阳性血管数。③电镜观察：观察3组肿瘤细胞的线粒体、内质网、细胞核、基质电子密度的变化。分析3组差异，推定普洛萘尔的治疗效果。

预测结果：没有做治疗的一组，肿瘤会继续增大，做传统化疗的一组可出现肿瘤减小，儿而毒副反应较多。用普萘洛尔治疗一组也会出现肿瘤减小，而副反应较少。最终确定普萘洛尔能否作为肿瘤治疗的靶向药物。进一步应用于临床病人的治疗。

经验数据：普萘洛尔是非选择性肾上腺B受体阻滞药，能竞争性拮抗神经递质(neurotransmitter)和儿茶酚胺(catecholamine)对B-受体的激动作用。临床上通常用于治疗高血压、室上性心动过速、缺血性心脏病、心律失常等。在婴幼儿和儿童一般用来治疗心脏疾病或新生儿甲状腺功能亢进症[18]，尚未发现由肾上腺素受体阻滞药直接引起的死亡或严重心脏问题。40多年临床实践证实普萘洛尔安全、耐受性好。已有关于应用普萘洛尔成功治疗颜面部[19]、眼部[20-23]、呼吸道[24-28]、肝脏[29，30]以及其他伴有并发症、多病变部位、甚至严重威胁患儿生命的重症IH[31-33]的大量报道，并证实了普萘洛尔能改变IH的自然病史、阻滞其增殖、介导并促进IH的早期凋亡。进一步的研究表明，普萘洛尔对处于增殖期与消退期的IH均有显著疗效[34，24]。另外，单独使用普萘洛尔(而不借助其他任何药物治疗或手术治疗等手段)治疗IH也已经被证实有确切疗效[35，36]，从而消除了对IH的治疗效果是由其他治疗手段所主导的疑虑。诸多学者推荐其取代皮质类固醇激素,成为IH的一线治疗手段[24，37-39]。中华口腔医学会口腔颌面外科专业委员会脉管性疾病学组也已确定普萘洛尔为治疗血管瘤的一线药物，并纳入《口腔颌面部血管瘤治疗指南》[39]。

假设结果：当前治疗肿瘤仍然是我们医学工作者的重点工作。肿瘤治疗传统的化疗药物，毒副反应较多。靶向药物价格昂贵，使很多贫穷地区的患者无奈的放弃治疗，令人痛心。普萘洛尔如果能够作为治疗肿瘤的靶向药物，就可以解决毒副反应多、药费昂贵弊端。对于贫穷、欠发达国家的患者堪称福音。

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