糖尿病肾病的生物标志物

安　玉　综述　蒋　松　审校

糖尿病肾病(DN)是糖尿病患者常见的微血管并发症，是引起终末期肾病(ESRD)的主要病因之一，严重影响患者生活质量，造成巨大的社会和经济负担。然而，仅30%～40%的1型糖尿病患者和15%～20%的2型糖尿病患者会进展至DN[1]。因此，寻找早期诊断DN、判断病情严重程度的生物标志物显得尤为重要。由于DN的发病机制涉及多种基因、蛋白质、代谢和环境因素，其生物标志物也多种多样。本文就目前DN生物标志物的研究现状作一综述。

传统的DN生物标志物

上世纪80年代以来，蛋白尿和微量白蛋白尿一直被认为是诊断DN的金标准，并由此决定DN的分期[2]。然而，越来越多的研究表明，蛋白尿尤其是微量白蛋白尿在DN的诊断上缺乏敏感性和特异性，且尿蛋白在判断肾功能预后方面受到很大限制[3-5]。相当一部分1型糖尿病患者在尿白蛋白正常时即出现肾功能减退，或尿微量白蛋白稳定时仍出现肾功能持续减退。因此，人们对于影响尿蛋白进展因素的关注越来越多的转移到影响早期肾功能减退的相关机制上。

血清肌酐(SCr)、胱抑素C等反映肾小球滤过功能的指标是目前临床应用的另一大类判断DN进展的生物标志物。然而，此类生物标志物同样存在敏感性和特异性不高的问题，尤其是在肾脏代偿功能良好时不能准确反映肾脏受损情况[6]。SCr还受年龄、体重、蛋白摄入量等多种因素影响。胱抑素C作为一种内源性蛋白酶抑制剂，可经肾小球自由滤过，不受上述因素影响，在反应早期肾小球滤过功能的敏感性方面优于SCr。但由于其检测价格较昂贵，且在炎症、激素治疗、甲状腺功能亢进等情况下反映的肾小球滤过率(GFR)较实际偏低，因此在临床应用上尚不能取代SCr。

基于肾小球滤过膜损伤的生物标志物

基于足细胞损伤的生物标志物足细胞即肾小球脏层上皮细胞，是一种高度终末分化的突状细胞。正常情况下足细胞及其足突与肾小球基膜(GBM)、毛细血管内皮细胞一起，构成肾小球滤过屏障。以往认为，肾小球系膜基质增多是DN的主要病理改变，然而，新的研究发现，足细胞损伤在DN的发展中同样起关键作用[7]。

有证据表明在DN发展早期即出现足细胞结构和功能的改变，主要表现足细胞凋亡或从GBM脱落所导致的足细胞数目减少，足突融合、消失，逐步出现肾小球纤维化[7，8]。有趣的是，许多尿液中的足细胞实际是存活的，且足细胞尿在反映活动性肾小球损伤的敏感性方面优于蛋白尿[8]。因此，尿中足细胞及其特异性蛋白产物有可能作为DN肾小球损伤的生物标志物[8]。然而，由于足细胞尿的检测十分耗时，且高度依赖于检测者的水平，目前在临床上推广足细胞尿的检测还存在很大的技术难度。

对足细胞特异性蛋白产物的研究主要集中在足细胞裂孔隔膜蛋白(nephrin、podocin)和细胞骨架蛋白(synaptopodin)上。上述三种蛋白质在DN患者肾组织中的表达均下调，近来其作为尿液标志物的研究也有了新的进展[9]。Wang等[10]通过实时定量PCR检测尿mRNA的方法发现，与正常对照组相比，DN患者尿中nephrin、podocin和synaptopodin的表达均上调，其中，nephrin和synaptopodin的表达与蛋白尿和肾功能相关。Jim等[11]对2型糖尿病患者的研究表明，所有出现微量白蛋白尿和蛋白尿的DN患者与54%白蛋白尿正常的DN患者，均出现尿nephrin水平的升高。尿nephrin水平与蛋白尿和收缩压水平显著相关，而与血白蛋白水平和eGFR无关，提示尿nephrin可能作为一种临床前期DN的生物标志物[11]。

基于内皮细胞损伤的生物标志物糖尿病患者微血管并发症(如肾脏、视网膜病变)均与内皮细胞功能密切相关。晚期DN患者在病理上常表现出典型内皮细胞受损改变，如肾小球微血管瘤、系膜溶解、K-W结节等[12]。内皮细胞损伤可直接影响肾小球滤过膜通透性的改变，因而一些反映内皮细胞功能的指标可能具有判断DN损伤程度的潜能。

早在1989年，Jensen等[13]首次发现1型糖尿病患者血浆血管性血友病因子(vWF)水平升高，证实糖尿病患者存在内皮细胞损伤。随后的研究表明，无论是1型还是2型糖尿病患者，血浆vWF水平均与肾小球损伤程度呈正相关，vWF水平正常者肾脏形态学变化多不明显[12]。此外，许多内皮细胞黏附分子在DN患者也有不同程度的改变[14]。

细胞间黏附分子1(ICAM-1)是一种介导T细胞与内皮细胞相互作用的黏附分子。体内外研究发现，DN患者血浆ICAM-1水平升高，并与肾脏损伤程度直接相关。在基线ICAM-1水平较高的1型糖尿病患者，进展至持续微量白蛋白尿的风险倍增，同时尿蛋白排泄率增加的速度也加快[15]。血管细胞黏附分子1(VCAM-1)是表达在内皮细胞和平滑肌细胞表面的另一种黏附分子。DN患者血浆VCAM-1水平亦升高，并与尿蛋白直接相关。在一项针对2型DM患者的前瞻性研究中发现，血浆VCAM-1水平升高，患者死亡的风险增加[14,16]。

基于GBM损伤的生物标志物细胞外基质和GBM增厚是DN的主要病理特点之一。糖尿病患者在正常白蛋白尿时即出现GBM增厚[17]。Ⅳ型胶原是一种分子量为540 kD的大分子蛋白，是GBM及细胞外基质的主要组成成分。由于正常情况下血浆Ⅳ型胶原不能通过肾小球滤过屏障，因此在一定程度上，尿液Ⅳ型胶原可反映GBM损伤情况。

横断面研究表明，DN患者尿液Ⅳ型胶原浓度在微量白蛋白尿出现前已升高，并随着蛋白尿和SCr的增加逐步升高[18]。近来通过对1型糖尿病和2型糖尿病患者的长期随访观察发现，尿液Ⅳ胶原浓度与eGFR的下降显著相关[19，20]，提示尿液Ⅳ型胶原可能作为DN早期诊断和判断预后的生物标志物。然而，由于关于Ⅳ型胶原的研究多集中在日本人群中，且受到样本量的限制，其作用有待更进一步的研究证实。

基于肾小管损伤的生物标志物

肾小管间质同样在DN的发展中起着重要作用，其病变严重程度与DN远期预后密切相关。敏感的肾小管标志物在损伤早期、肾脏形态学改变轻微时即出现异常，在评价DN的预后与监控治疗效果方面具有巨大的潜能[21]，因而成为当前研究的热点。

肾小管标记物主要有嗜中性粒细胞明胶酶相关的脂质运载蛋白(NGAL)、肾损伤分子1(KIM-1)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、肝脏脂肪酸结合蛋白(LFABP)及心脏脂肪酸结合蛋白(HFABP)等[22]。其中，NGAL、KIM-1、NAG、LFABP主要与近端肾小管损伤有关，而HFABP主要与远端肾小管损伤有关。已知上述标志物在早期诊断急性肾损伤方面作用确切，近来其在慢性肾脏病中的作用也备受关注。

据Nielsen等[23，24]报道，1型糖尿病患者尿NGAL、LFABP水平在出现蛋白尿和微量白蛋白尿之前即已升高。然而，一项对基线尿蛋白水平为1 141 mg/24h的1型糖尿病患者随访3年的研究表明，尿LFABP与GFR的下降并无相关性，提示LFABP可能在疾病早期诊断比较有效，而在DN晚期作用不明显[25]。该项研究同时发现，尿NAGL、KIM-I水平的升高与GFR的下降相关，经尿蛋白、收缩压等校正后，这种相关性不复存在，似乎说明这两种肾小管标志物与已知的影响慢性肾脏病进展的因素相比并无优势。经过氯沙坦(100 mg/d)治疗1年可使1型DN患者尿KIM-1水平下降43%。与此同时，Nauta等[26]在另一项横断面研究中发现，与非糖尿患者相比，1型糖尿病患者尿NAG、NGAL、HFABP水平在正常白蛋白尿时即明显升高，并随着蛋白尿的增多进一步升高，其水平与蛋白尿和eGFR显著相关，而与年龄、性别、相应标志物的血浆浓度无关。然而，经蛋白尿校正后，仅尿HPABP与eGFR仍呈显著相关性，提示HPABP有望成为评价DN远期预后的新型生物标志物。

基于系统性炎症的生物标志物

慢性微炎症状态是DN的另一特点。在DN发展的每一阶段，始终伴随着炎症细胞的浸润，细胞外基质成分的增多，表现为肾小球系膜基质增生，肾小管基膜增厚，最终出现球性废弃和间质纤维化。多种炎性细胞因子、趋化因子及其受体、黏附分子及转录因子等构成复杂的分子网络，参与DN的病理生理过程，不仅为DN的治疗靶点提供了新的思路，某些关键的炎症分子也可能成为DN诊断与判断预后的生物标志物[14]。

研究表明，多种细胞因子如白细胞介素6(IL-6)、IL-18、成纤维细胞生长因子23(FGF-23)、转化生长因子β(TGF-β)、单核细胞趋化蛋白1、结缔组织生长因子等都可能是潜在的DN生物标志物[14，27，28]。例如，前瞻性研究表明，DN患者血清及尿液IL-18水平不仅与蛋白尿直接相关，同时血清IL-18水平的升高还可预测2型糖尿病患者早期肾功能的下降[14]。FGF-23同样被认为是可以判断DN患者肾脏预后的独立因素，当血清FGF-23浓度>70 pg/ml时，发生死亡、SCr倍增、透析等风险显著增加[28]。

引人注目的是，近期有两项分别对628例1型糖尿病患者和410例2型糖尿病患者随访12年的大型前瞻性研究表明，肿瘤坏死因子α受体(TNFR)在判断DN预后方面具有令人振奋的潜能[29，30]。据报道，无论是1型糖尿病还是2型糖尿病，血清TNFR水平的升高均与肾功能的下降显著相关，且这种相关性不受尿蛋白及血管紧张素转化酶抑制剂治疗的影响。TNFR1水平对判断2型糖尿病患者预后更有意义，而TNFR2在1型糖尿病患者更有意义。由于DN的进展受到多种因素影响，单一的生物标志物仅仅反映了一系列生物过程的协同作用，其有效性与稳定性都有待更多的临床实践进一步证实[31]。

系统生物学方法在寻找DN标记物中的应用

随着人类基因组计划工作的完成、现代分子基因技术的不断更新和计算机技术在生命科学领域的广泛应用，系统生物学研究给肾脏病学的发展带来了新的动力。高通量的基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等从整体角度出发，研究复杂疾病所涉及的多种基因、蛋白质及代谢产物，对于加深疾病认识、寻找新的治疗手段意义重大，同时也为发现有效的生物标志物提供了新的视野。

基因组学与以往遗传学研究仅集中于少数候选基因不同，基因组学是对整个人类基因组序列进行研究。全基因组关联分析研究(GWAS)无需募集遗传家系，直接通过高通量测序技术，检测整个基因组中数以万计的遗传标记与疾病之间的关联。目前针对1型和2型DN开展的GWAS研究，均已发现了多个与DN的易感性相关的基因位点[32，33]，而对其表达的蛋白质产物的研究必将有助于新的DN生物标志物的发现。

蛋白质组学蛋白质组学是一种利用质谱方法进行高通量蛋白质成分检测，并通过生物信息学工具进行分析和处理的新技术[34]。尿液蛋白质组学由于其无创性受到更多的重视。迄今为止，通过蛋白质组学的方法，已发现34种不同的蛋白质在DN患者的尿液中表达上调，另有34种蛋白质表达下降[35]。已知的443种尿液蛋白肽段中，约50%含有Ⅰ型胶原α1和Ⅲ型胶原α1片段，后续的临床试验证实，尿液Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原片段可能是比蛋白尿更早期、特异性更高的生物标志物[36]。

代谢组学代谢组学作为基因组学和蛋白质组学的延伸，是对生物样本(血液、尿液、组织等)进行气相或液相色谱分离后，通过代谢谱差异分析，了解体内或体外代谢过程的研究方法[37]。由于DN是一种受多种因素影响的代谢紊乱性疾病，而代谢组学恰恰让我们了解在遗传背景、环境因素、生活方式等多种因素相互作用下机体不同的代谢反应，因而特别适用于寻找DN生物标志物。目前已有多种糖代谢、脂代谢及氨基酸代谢产物经过代谢组学的方法被证实具有作为DN新的生物标志物的潜能[38]。

虽然系统生物学在DN研究中的应用，使得我们在增加对DN分子机制了解的基础上，发现了一系列具有早期诊断和预后判断潜能的分子标志物。然而，由于缺乏统一的研究设计、标本处理标准和统计学分析方法，如何从系统生物学的海量实验数据中获得有意义的信息并进行大样本的临床验证，是目前亟需解决的难题。因此，有学者提出，在未来系统生物学领域的研究，可能需要整合基因组学、蛋白质组学和代谢组学等多维数据，以获取更加确切的信息，并进行大样本的临床验证试验[22]。

综上所述，目前在DN发病各个环节寻找有效的生物标志物均已有了很大进展。然而，遗憾的是，尽管蛋白尿和微量白蛋白尿作为DN生物标志物有着显著的缺陷，临床上至今尚无有效的生物标志物能够取代其在DN诊断与判断疗效方面的地位。现有的对DN各种生物标志物的研究多属横断面研究，大多数研究所纳入的病例并非经肾活检明确诊断的DN，部分研究在评估肾小球滤过功能方面采用胱抑素C、SCr、eGFR等代替实际GFR，可能会给实验结果带来一定误差。同时，现有研究多局限于某一特定种族，而遗传背景在DN发病机制中无疑扮演着重要角色。更多基于系统生物学研究结果的前瞻性、多中心、大样本的临床验证试验有待进一步实施。

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