β淀粉样蛋白来源的扩散性配体对胞外信号调节激酶活性的影响*

鲍兆祥，张 雪， 高 灿

(1.徐州医学院江苏省脑病生物信息重点实验室，江苏 徐州221004； 2.徐州医学院江苏省麻醉学重点实验室，江苏 徐州 221004)

前言

阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，简称AD)，是一组病因未明的原发性退行性脑变性疾病，是老年人最为常见的痴呆类型.随着社会的老龄化，该病已成为现代社会老年人的主要致死疾病之一.因而，研究老年痴呆疾病早期认知功能障碍的分子机制，对预防和早期治疗AD更具有临床意义和社会价值.在AD病人的大脑中Aβ的总量是增加的，且其含量的高低与学习记忆的损伤有密切的关系.而这其中Aβ1-42具有高的疏水性，且更容易在细胞外聚集[1].因此，Aβ1-42是体外模拟AD疾病模型最常用的Aβ小肽.Aβ是由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)在β- 和γ- 分泌酶相继作用后产生的.早期认为Aβ沉积形成的淀粉样纤维是介导神经元死亡的主要病因[2,3].但是大量临床证据表明AD的认知功能障碍在淀粉样纤维形成之前就有发生，淀粉样纤维并不能解释AD病人的认知障碍.Oda等人[4]的研究表明是可溶性的Aβ聚集体而不是Aβ纤维在AD的发病机制中发挥重要作用.Aβ寡聚体最初是被 Roher等人在1991年时发现的，直到1998年由Lambert等人将Aβ来源的扩散性配体(Aβ-derived diffusible ligands)称为ADDLs[5]，即具有神经毒性的可溶性、非纤维化、具有配体结合特征的Aβ寡聚体.近年来越来越多的研究表明，ADDLs，这种可溶性的寡聚体作为AD发病的关键分子，在突触可塑性改变和随后的记忆功能损伤及认知功能障碍方面的作用已被广泛接受[3,5,6].现在被普遍接受的寡聚体假说认为：Aβ升高增加了ADDLs的形成，ADDLs和相关受体以高度亲和力相结合，进而诱导产生突变信号——一方面阻断LTP导致记忆受损，另一方面持久作用于下游信号通路，导致神经元损伤死亡[3].

N-甲基-D-天冬氨酸 (N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受体作为突触后兴奋性谷氨酸受体，在中枢神经系统中起着重要作用.现在研究证明NMDA受体不仅存在于突触上，而且还存在于突触外位点.突触外的NMDA受体作为一种储备受体，当突触上的NMDA受体功能发生障碍时，突触外储备的NMDA受体就会通过侧向的扩散进入突触后位点，补偿由于功能障碍而损失的NMDA受体，进而使得突触正常发挥其生理功能[7,8].关于突触外的NMDA受体的功能，一种观点认为突触外的NMDA受体与突触上的NMDA受体有着截然相反的功能，突触上的NMDA受体介导着细胞的存活，而突触外的NMDA受体介导着细胞的死亡[9].

细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2)是细胞内重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，p-ERK1/2是其活性形式[10].ERK1/2的底物包括细胞内其他重要的激酶、转录因子、组蛋白以及K+通道等，这些物质是细胞内的重要组成成分，在学习记忆形成过程中必不可少，同时ERK1/2可能参与了神经元形态学可塑性的形成过程[11,12].在细胞内，ERK1/2信号转导通路可以被多种途径激活，其中主要的有Ca2+途径，AC/cAMP/PKA途径，NMDA受体途径，受体酪氨酸激酶途径，G蛋白耦联受体途径等[12,13].目前，关于NMDA受体途径如何激活ERK1/2信号转导通路的研究受到众多学者的认可.研究表明NMDA受体可以通过多种方式激活ERK1/2信号通路，如受体活化后引起的Ca2+内流.而且Ras和MAPK/ERK1/2三级级联反应中，Raf-1、MEK、ERK1/2是NMDA受体复合体的主要组成成分[11～13].NMDA受体对ERK1/2信号通路的调节作用不但对突触活动产生神经性应答，而且对认知功能以及神经可塑性都有重要作用[12～14].

有观点认为突触上的NMDA受体的激活引起了ERK1/2的激活，ERK1/2磷酸化后与下游物质发生一系列反应，之后被长距离运输到细胞核内，从而发挥作用[15].虽然该理论已经被广泛接受，但是也有人对此持不同的观点.激活突触外的NMDA受体会使Ras失活[16]，失活的Ras也就无法使其下游底物ERK1/2磷酸化激活，进而使得ERK1/2无法向核内转位作用其下游底物CREB.那么，ADDLs是否会对ERK1/2信号通路产生影响？ERK1/2信号通路是否受到NMDA受体的调节，到底是突触上的NMDA受体还是突触外的NMDA受体发挥更重要作用？ADDLs对NMDA受体的影响与ADDLs对ERK1/2信号通路产生的影响是否存在某种内在的联系？

本文通过细胞和整体水平研究，阐明ADDLs 对ERK1/2信号通路影响的机制，揭示ADDLs影响突触可塑性导致认知功能障碍的分子机制.本研究将拓宽研究AD疾病的新思路，并为基于ERK1/2信号通路及突触可塑性的神经保护治疗和药物研发提供新的靶点.

1 离体实验

1.1 ADDLs对ERK1/2信号通路的影响

1.1.1 ADDLs对ERK1/2磷酸化水平的影响

为了研究ADDLs对ERK1/2信号通路的影响，在培养的18～20 d的大鼠海马神经元上，给予500 nmol/L ADDLs，分别作用了1 h, 3 h, 6 h, 24 h.我们首先应用免疫印迹的方法检测了ERK1/2磷酸化水平的变化情况，结果显示给于ADDLs 3 h, 6 h, 24 h均明显降低了ERK1/2磷酸化水平.其中在6 h ERK1/2的磷酸化水平降到最低，24 h有所回升.

1.1.2 ADDLs对细胞不同部位ERK1/2磷酸化水平的影响

ERK1/2信号通路激活会导致ERK1/2的磷酸化，磷酸化的ERK1/2可以向核内转位[17]，作用于核内的下游信号分子，从而发挥重要作用.那么ADDLs是否会对ERK1/2的这种转位活动产生影响呢？为此以培养20 d的原代海马神经元为材料，利用组分提取试剂盒，分别得到了海马神经元不同的组分蛋白——细胞质、细胞膜、细胞核，免疫印迹结果显示，ADDLs对细胞质、细胞膜、细胞核中ERK1/2磷酸化水平的影响在时间上呈现明显的差异.ADDLs作用1 h后明显降低了细胞质中ERK1/2磷酸化水平，但是细胞膜中ERK1/2磷酸化水平在6 h才出现显著性降低，而细胞核中则需要24 h才有显著性降低的表现.

1.2 ADDLs通过突触外NMDA受体影响ERK1/2信号通路

研究表明，激活突触外的NMDA受体会使Ras失活[16]，失活的Ras也就无法使其下游底物ERK1/2磷酸化激活，进而使得ERK1/2无法向核内转位作用其下游底物CREB.在前言中也提到GluN2B亚基主要分布在突触外膜上，那么ADDLs是否通过突触外NMDA受体影响ERK1/2信号通路？在培养的大鼠海马神经元上，按高灿等人已建立的方法[18],选择加入NMDA 20 μmol/L、Gly 20 μmol/L激活5 min，制作激活突触外的NMDA受体的细胞模型.IB结果显示，单独激活突触外的NMDA受体和给予ADDLs后再激活突触外的NMDA受体，ERK1/2的磷酸化水平均明显降低，没有显著性差异.这说明ADDLs通过突触外受体影响ERK1/2信号通路.

2 在体实验

2.1 APP小鼠学习记忆受损

将饲养至9个月的转入APP(淀粉样前体蛋白)基因的AD模型小鼠(简称APP小鼠)，按基因型分为WT(野生型)组和APP组，进行水迷宫实验.小鼠连续接受5天训练，每天4 次，每次在平台上逗留30 s, 记录小鼠分别从4个象限不同入水点入水找到平台所需的时间，即潜伏期(escaping latency).4 次潜伏期成绩的平均值作为当日最终成绩进入最后统计.如果小鼠在90 s 内未找到平台，其潜伏期按90 s 计算.记录小鼠每天在平台所在象限即目的象限(target quadrant)停留的时间.第6天撤除平台，从任一入水点将小鼠面向池壁放入水中，记录90 s 内小鼠的游泳轨迹并进行分析.观察分析小鼠停留各象限的时间百分比.迷宫上方安置带有显示系统的摄像机，计算机自动跟踪计时并记录游泳轨迹，Anymaze软件分析结果.水迷宫实验显示APP小鼠比野生型的小鼠要花更长的时间才能找到目标平台，说明APP小鼠的学习记忆已经受损.

2.2 APP小鼠ERK1/2磷酸化水平降低

APP小鼠是目前比较常用的用于研究AD的实验动物，由于该小鼠转入了APP基因，所以其大脑中能够产生大量的Aβ，且Aβ能够在细胞外寡聚化进而形成ADDLs，而ADDLs是目前认为的损伤学习记忆的主要元凶之一.分别将WT与APP组实验小鼠深度麻醉断头取海马进行样品的处理，进行免疫印记分析.结果显示，APP小鼠ERK1/2的磷酸化水平显著降低.

3 讨论

AD的主要症状是记忆丧失，虽然目前有一些关于ADDLs如何最终损伤学习记忆的研究，也有很多有意义的研究结果，但是依然有很多机制有待去了解.MAPK/ERK信号通路与脑内长时程增强(LTP)的形成以及学习记忆功能的重要联系一直是众多学者研究的热点.研究结果表明,ERK1/2可以通过多种方式影响中枢神经系统信息的长期存储[11～13]，如ERK1/2调控海马神经元树突棘结构的形成与变化；ERK1/2可直接参与调控树突蛋白合成，且此蛋白合成为LTP形成及记忆功能所必需；ERK1/2与突触结构蛋白(如脚手架蛋白)的相互作用共同参与突触和神经元的可塑性改变，最终影响学习记忆功能.研究结果显示，ADDLs以时间依赖的方式抑制ERK1/2磷酸化水平.

ERK1/2信号转导通路被认为是细胞外多种刺激传向细胞内的交汇点[14].在细胞内能引起ERK1/2信号转导通路激活的路径主要有[11～13]：Ca2+途径；AC/cAMP/PKA途径；NMDA受体途径；受体酪氨酸蛋白激酶途径；G蛋白耦联受体途径.其中NMDA受体途径被研究的最为广泛.NMDA受体激活引起的Ca2+内流激活ERK1/2信号转导通路，一直以来都是人们研究的热点.另外，Ras、MERK1/2/ERK1/2三级级联反应中的Raf-1、MEK、ERK1/2是NMDA受体复合体的主要组成成分.受体酪氨酸蛋白激酶是催化NMDA受体发挥生物学功能的主要激酶.NMDA受体必须通过相关脚手架蛋白锚定于突触后膜上[19].突触内与突触外的NMDA受体有着不同的结构组成以及介导了不同的下游通路：激活突触内的NMDA受体促进细胞存活，而激活突触外的NMDA受体导致细胞死亡[14,20].早在1991年Bading等[14]报道了NMDA受体介导的Ca2+内流激活了ERK1/2，而这一过程是Ras依赖的，而激活突触外的NMDA受体会使Ras失活[20,21]，失活的Ras也就无法使其下游底物ERK1/2磷酸化激活.此外，当突触上的NMDA受体与突触外的NMDA受体同时被激活时，突触外的NMDA受体激活产生的效应占主导地位[22].研究结果显示，当特异性激活突触外NMDA受体，与对照组相比ERK1/2磷酸化水平明显降低.给予ADDLs(500 nmol/L)3 h后再激活突触外NMDA受体，ERK1/2的磷酸化水平较单独激活突触外NMDA受体组相比，具有更加明显的降低.说明ADDLs可能通过过度激活了突触外的NMDA受体，抑制了ERK1/2信号通路的激活.另外，我室前期研究结果表明，当GluN2B的特异性抑制剂Ro-256981与ADDLs联合给药时，ERK1/2的磷酸化水平较单独给予ADDLs组得到了恢复，而Ro-256981本身并不影响ERK1/2的磷酸化水平.结合下面的观点：在突触发生阶段，突触外NMDA受体主要由GluN2B组成，但不包含GluN2A；随着神经元的成熟，突触外NMDA受体的组成基本不变，此时突触上NMDA受体则主要由GluN2B逐渐转化为GluN2A[23～25].可以得到这样一个结论：ADDLs通过过度激活了突触外的NMDA受体，抑制了ERK1/2信号通路的激活.

激活的 ERK 可能有 3 种去向[26]:1)停留在胞质中，激活一系列其他蛋白激酶；2)在胞质中使细胞骨架成分磷酸化； 3)进入细胞核，通过磷酸化转录因子，调控基因的表达最终介导细胞的生长、分化、迁移、侵袭等多种过程.那么ADDLs通过过度激活了突触外的NMDA受体，抑制的ERK1/2信号通路发挥作用是否具有特异性？研究结果显示，ADDLs对细胞质、细胞膜、细胞核中ERK1/2磷酸水平的影响在时间上呈现明显的渐进性.ADDLs作用1h后明显降低了细胞质中ERK1/2磷酸化水平，但是细胞膜中ERK1/2磷酸化水平在6 h才出现显著性降低，而细胞核中则需要24 h才有显著性降低的表现.说明ADDLs对ERK1/2信号通路的影响在时间和空间上均有不同，即ADDLs对ERK1/2信号通路的影响是有一定的时序性.这也提示了作为多种信号通路的汇集点，ERK1/2信号传导是非常精确和复杂的.

ADDLs影响学习记忆的机制是复杂的，其中绝大多数机制是不明确的.实验结果表明，ADDLs通过过度激活了突触外的NMDA受体，抑制了ERK1/2信号通路的激活，而ADDLs对ERK1/2信号通路的影响具有一定的时序性.ADDLs在抑制该通路的同时也可能抑制了其他有助于学习记忆形成与巩固的通路，这些通路有的是已知的，然而绝大多数是未知的.笔者仅对该通路进行了观测，研究结果仅表明ADDLs通过过度激活了突触外的NMDA受体，抑制了ERK1/2信号通路的激活，是导致学习记忆能力降低的可能原因之一.希望本研究为研究AD学习记忆损伤提供一个新的思路和方向，为将来AD的治疗提供理论基础.

参考文献:

[1]Takahashi R H, Almeida C G, Kearney P F, et al. Oligomerization of Alzheimer’sβ-Amyloid within Processes and Synapses of Cultured Neurons and Brain [J]. J. Neuroscience, 2004, 24(14): 3592-3599.

[2]Opazo P, Choquet D. A three-step model for the synaptic recruitment of AMPA receptors [J]. Molecular and Cellular Neuroscience, 2011, 46(1):1-8.

[3]Grant A, Kraff t, Klein W L. ADDLs and the signaling web that leads to Alzheimer’s disease [J]. Neuropharmacology, 2010, 59(4-5): 230-242.

[4]Oda T, Wals P, Osterburg H H, et al. Clusterin (apoJ) alters the aggregation of amyloid beta-peptide (A beta1-42) and forms slowly sedimenting A beta complexes that cause oxidative stress [J]. Exp Neurol., 1995, 136(1): 22-31.

[5]Lambert M P, Barlow A K, Chromy B A,et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95(11): 6448-6453.

[6]Ferreira S T, Klein W L. The Aβoligomer hypothesis for synapse failure and memory loss in Alzheimer’s disease [J]. Neurobiol Learn Mem.,2011,96(4), 529-543.

[7]Groc L, Heine M, Cousins S L, et al. NMDA receptor surface mobility depends on NR2A-2B subunits [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2006,103(49): 18769-18774.

[8]Goebel-Goody S M, Davies K D, Alvestad Linger R M, et al. Phospho-regulation of synaptic and extrasynaptic N-methyl-d-aspartate receptors in adult hippocampal slices [J]. Neuroscience, 2009, 158(4):1446-1459.

[9]Papadia S, Harding G E. The dichotomy of NMDA receptor signaling [J]. Neuroscience, 2007, 13(6):572-579.

[10]Patterson M A, Szatmari E M, Yasuda R. AMPA receptors are exocytosed in stimulated spines and adjacent dendrites in a Ras-ERK-dependent manner during long-term potentiation [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2010, 107(36): 15951-15956.

[11]刘辉，董兆军.MAPK/ERK信号通路与学习记忆功能[J].国际神经病学神经外科学杂志, 2005, 32(5):480-482.

[12]胡亚卓，吕佩源.MAPK/ERK信号转导通路与学习记忆[J].中国神经免疫学和神经病学杂志, 2006,13(6)：625-630.

[13]严洪新，徐恩.细胞外信号调节激酶与缺血性脑卒中[J].现代医学, 2010,38(4):427-430.

[14]Bading H, Greenberg M E. Stimulation of protein tyrosine phosphorylation by NMDA receptor activation [J]. Science, 1991, 253 (5022):912-914.

[15]Khokhlatchev A V, Canagarajah B, Wilsbacher J, et al. Phosphorylation of the MAP Kinase ERK2 Promotes Its Homodimerization and Nuclear Translocation[J]. Cell, 1998, 93(4): 605-615.

[16]Kim M J, Dunah A W, Wang Y T, et al. Differential roles of NR2A-and NR2B-containing NMDA receptors in Ras-ERK signaling and AMPA receptor trafficking[J]. Neuron, 2005, 46(5): 745-760.

[17]Li S, Jin M, Koeglsperger T, et al. Soluble Aβ Oligomers Inhibit Long-Term Potentiation through a Mechanism Involving Excessive Activation of Extrasynaptic NR2B-Containing NMDA Receptors [J]. J. Neurosci., 2011, 31(18): 6627-6638.

[18]Gao C, Gill M B, Tronson N C, et al. Hippocampal NMDA receptor subunits differentially regulate fear memory formation and neuronal signal propagation[J].Hippocampus, 2010, 20(9), 1072-1082.

[19]Alexander Z H, Diana L P. Extrasynaptic and synaptic NMDA receptors form stable and uniform pools in rat hippocampal slices [J]. J Physiol, 2007, 584(Pt2): 509-519.

[20]孙楠，高灿.美金刚保护缺血神经元分子机制的研究[J].徐州医学院学报，2013,33(8):491-495.

[21]Wang C C, Held R G, Chang S C, et al. A critical role for GluN2B-containing NMDA receptors in cortical development and function [J]. Neuron, 2011, 72(5):789-805.

[22]Groc L, Heine M, Cousins S L, et al. NMDA receptor surface mobility depends on NR2A-2B subunits [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103(49):18769-18774.

[23]Monyer H, Burnashev N, Laurie D J, et al. Developmental and regional expression in the rat brain and functional properties of four NMDA receptors [J]. Neuron,1994, 12(3):529-540.

[24]Groc L, Bard L, Choquet D. Surface trafficking of N-methyl-D-aspartate receptors: Physiological and pathological perspectives [J]. Neuroscience, 2009, 158(1): 4-18.

[25]Bard L, Groc L. Glutamate receptor dynamics and protein interaction: lessons from the NMDA receptor [J]. Molecular and Cellular Neuroscience, 2011, 48(4): 298-307.

[26]马景德，齐秀.MAPKs信号通路及其与疾病关联性的研究现状[J].临床军医杂志, 2004,32(2):95-97.