大蒜素及前药对人食管癌细胞 Eca9706 的增殖抑制及其凋亡基因表达的影响

常全娥， 苟 萍

（新疆大学生命科学与技术学院， 新疆 乌鲁木齐 830046）

大蒜素及前药对人食管癌细胞 Eca9706 的增殖抑制及其凋亡基因表达的影响

常全娥， 苟 萍*

（新疆大学生命科学与技术学院， 新疆 乌鲁木齐 830046）

目的 研究大蒜素和它的前药 (蒜氨酸 +蒜氨酸酶) 对食管癌细胞 Eca 9706 的增殖抑制及对凋亡基因表达的影响。 方法 用大蒜素和大蒜素前药处理食管癌细胞 Eca 9706, 采用 MTT法检测癌细胞的增殖抑制作用, 实时定量RT-PCR检测凋亡基因的表达。 结果 大蒜素及其前药对食管癌细胞增殖抑制呈现时间和剂量相关性, 大蒜素前药的抑制效果优于大蒜素。 实时定量 RT-PCR表明大 蒜素和它的前药上 调了癌细胞 bax和 caspase-3 mRNA的表 达, 下调survivin、 突变型 p53 和 bcl-2 mRNA的表达。 结论 大蒜素及其前药抑制食管癌细胞增殖和诱导凋亡可能是通过线粒体通路实现。

大蒜素；大蒜素前药；食管癌细胞；细胞增殖；细胞凋亡

近年来恶性肿瘤的发病率和死亡率均呈上升趋势,已成为常见病和多发病。食管癌是人类消化道的常见肿瘤, 我国每年因食管癌死亡者约15万人,占癌症患者死亡率近 1/4, 位居第二位。 我国抗肿瘤药物近10年来取得了令人瞩目的成就。 现能生产的抗肿瘤药物 (不含免疫调节剂) 包括:烷化剂类、抗代谢药、天然抗肿瘤药、抗肿瘤抗生素等,但多数抗肿瘤药物存在毒副作用较大,疗效不稳定、复发率高等问题。因此,寻找一种低毒、疗效稳定、使用方便且具有广谱抗肿瘤活性的药物成为抗肿瘤药物研究和临床中亟待解决的问题。肿瘤的中药治疗是当今临床治疗的重要手段之一,中草药及其活性成分抗肿瘤药物的研究和开发已成为人们关注的热点, 我国具有 1 000 多年中草药研究的悠久历史,有很多的古代偏方和有名中医的经验方,开发中草药抗肿瘤药物具有广阔的发展前景。

大蒜 Allium sativum L.是 历 史 悠久的药 食 两 用植物, 早在 4 000 多年前人们就开始食用大蒜, 并用大蒜治疗疾病。大蒜的多种药理作用主要源于它所特有的有机含硫化合物,如蒜氨酸及其分解产物大蒜素［1-3］等, 大蒜组织损伤时释放蒜氨酸酶 (Alliinase), 蒜氨酸酶催化蒜氨酸缩合形成具有强烈辛辣味的挥发性大蒜素 (Allicin, 主要成分是二烯丙基硫代亚磺酸脂)。 大蒜素遇光、 热容易降解成二烯丙基三硫和二烯丙基二硫化合物 (DADS) 等含硫有机化 合 物［3］。 近 年 来 国 内 外 研 究 表 明, 大蒜素对胃癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌等癌细胞有明显抑制 作 用［4-7］。 发 现 大 蒜 素 通 过 抑 制 肿 瘤 细 胞的增殖,影响细胞周期,诱导肿瘤细胞凋亡,对抗癌 药 具 有 增 敏 作 用［4-5,7-9］等 抑 制 或 杀 死 肿 瘤 细 胞 。大蒜素生 物 半衰期短 (t1/2=2.32 h), 理 化 性 质 不稳定,在常温下可进一步分解,引起分子中二硫键断 裂,降 解 成 各 种 化 合 物,如 阿 藿 烯 类(ajoenes) 、 乙 烯 基 二 硫 杂 苯 类 (vinyldithiins) 和硫醚类 (sulfides) 等有机硫化合物, 导致活性大大降低, 影 响其药理作 用 及 疗效［10］。大 蒜 素 前 药(蒜氨酸和蒜氨酸酶) 较稳定, 本实验通过比较大蒜素及大蒜素前药对食管癌 Eca9706 细胞的增殖抑制作用, 以及检测 bcl-2、bax、 survivin、caspase-3和 p53 基因在转录水平的变化, 为探讨大蒜素及其前药诱导食管癌凋亡的分子机制及抗肿瘤治疗提供可靠的依据。

1 仪器和实验材料

Real Time PCR检 测 系 统 (Applied Biosystems 7500 型, 美 国) ； 凝 胶 成 像 系 统 (Alpha Innotech Corporation TM-26 型, 美 国)； 真 空 冷 冻 干 燥 机(Christ Alpha 1-2 LDplus型, 德 国)； 倒 置 显 微 镜( 江 南 XD-101 型, 中 国) ； 酶 标 仪 (Feic Benchmark Plus型, 美 国 )； CO2细 胞 培 养 箱 (Heal Force HF240 型, 中国)。

新鲜大蒜 (本地购买), 人食管癌 Eca9706 株由郑州大学基础医学院董子明教授馈赠,新疆生物资源基因工程重点实验室保存。

蒜 氨 酸 (Sigma), 二 烯 丙 基 二 硫 化 物(DADS, 纯 度 为 80%,Sigma) 。 RPMI1640 培 养基、 0.25%胰酶消化液、 二甲基甲砜 (DMSO)、四甲基硝唑蓝 (MTT)、 胰酶和 10%胎牛血清 (鼎国昌盛生物技术有限责任公司)； 青霉素和链霉素(ICN Biomedicals公 司)、 引 物 ( 上 海 生 工 生 物 技术有 限 公 司)； Trizol RNA提 取 液 和 SYBR Green Supermix kit(Invitrogen, 上 海 普 飞 生 物 技 术 有 限公司)； Tag DNA聚合酶、 DnaseⅠ、dNTP、 RNAse抑制剂 、 Oligo(dT)、 Reverse Transcriptase M-mLV (RNase H-) 和 DNA Marker(均为 大 连 TaKaRa公司产品)；其它试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 大蒜素的制备 大蒜素提取方法参照曾哲灵［11］方法进 行, 得 到的大蒜素 冷 冻 干燥, 大 蒜 素干粉得率 为 2.41 g/kg。 大蒜素 测定参 照 DTNB比色法进行［12］, 测得 大蒜素质量 浓 度 为0.3 μg/mL。称取 大 蒜 素 干 粉 45 mg溶 于 5 mL RPMI1640 培 养液, 配 置 质 量 浓 度 为 9 mg/mL, 过 滤 除 菌, 置-20 ℃冰箱 保存。临用前用 RPMI1640 培 养液分别稀释至 5、 10、 15、 20、30 μg/mL。

2.2 大 蒜 素前药的制 备 称取新 鲜 去 皮 蒜 瓣200 g,4 ℃ 预 冷, 加 入 预 冷 的 磷 酸 缓 冲 液 200 mL (蒜瓣∶提取液 =1 ∶1,W/V), 匀浆。 匀浆液在4 ℃低温 下 4 000 r/min 离 心 20 min, 弃 去 残 渣,在上清液中加入硫酸铵, 使饱和度为20%,4 ℃下静置 2 h,8 000 r/min 冷 冻 离 心 20 min, 弃 沉 淀 。上清液继续加入硫酸铵, 使饱和度达到 50%, 在4 ℃ 下 静 置过夜,4 ℃ 低 温 下 8 000 r/min 冷冻离心20 min, 沉淀冷冻干燥得到蒜氨酸酶。 蒜氨酸酶活力的测定采用丙酮酸法［13］。 分离得到的蒜氨酸酶活力单位为 24 720 U/mg,SDS-PAGE检测有一 条 主 要的蛋白 带 (图 1), 其 分 子质 量 大 小约 为54 kDa左右, 与已有的报道［14］分子质量大小一致。

将30 mg蒜 氨 酸 和 15 mg蒜 氨 酸 酶 混 合 溶 于5 mLRPMI1064 培 养液, 配置 成 9 mg/mL, 过 滤 除菌后置于 -20 ℃冰箱保存。 临用时, 用 RPMI1640培养液分别稀释至 5、 10、 15、 20、 30 μg/mL。

图 1 蒜氨酸酶 SDS-PAGE电泳Fig.1 SDS-PAGE of alliinase

2.3 体外细胞毒试验 （MTT法） 将对数生长期的食管癌细胞 Eca9706, 用 0.25%胰蛋白酶消化收集后, 进行细胞计数, 用新鲜的 RPMI1640 培养基稀释 Eca9706 至 2 ×104个/m L,100 μL/孔接种于96 孔板, 置于 37 ℃,5%CO2的饱和湿度培养箱中培养, 培养 12 h 后, 加入 100 μL制备好的大蒜素、 大蒜素前药 (5、 10、 15、 20、 30 μg/m L) 和4.8 μg/mL的阳性对照 DADS(DADS 用 DMSO配制成 0.5 mg/mL, 置 于 4 ℃ 保 存 。 临 用 前 用 新 鲜RPMI1640 培养液稀释至终质量浓度 4.8 μg/mL),阴性对照加入等体积的细胞培养液,空白对照组(无细胞) 加入等体积 PBS, 用于调零, 各组设 3个重复孔。 培养 24、48、 72 h 后, 弃 去 各 孔 培 养基, 每孔加入20 μL 5mg/mLMTT溶液和80 μL培养基, 继续培养4 h。 弃去各孔残液, 每孔加入二甲基亚砜 100 μL, 置 摇 床 上 低 速 振 荡 30 min, 使结晶物充分溶解。 用 酶标仪检测 490 nm波 长处测量各孔的吸光值 (A490)。

细胞生长抑制率 (%)=［(阴性对照组 A490-空白组 A490)-(实验组 A490-空白组 A490)/(阴性对照组 A490-空白组 A490)］ ×100%。

IC50的测定 测定方法同 MTT实验, 根据不同质量浓度大蒜素及其前药处理食管癌细胞不同时间的增殖抑制率,计算出达到最大抑制率一半时所对应的大蒜素及其前药的质量浓度 (IC50)。

2.4 实时定量 RT-PCR检测 分别收集经高、 中、低质量浓度 (10、 20、 40 μg/mL) 大蒜、 大蒜素前药处理不同时间 (24、 48、 72 h) 的 Eca9706 细胞, 并用 PBS 清 洗 3 次, 加 入 1 mL Trizol。用 Trizol法提取 Eca9706 细胞的总 RNA, 进行 cDNA反转录,按试剂盒说明书进行。

实时定量 RT-PCR检测采用 Sybrgreen 法, 每一个样品同时进行 β-actin 和 survivin、 p53、 bcl-2、 bax、 caspase-3 基 因 的 检 测。 总 反 应 体 系 为25.0 μL, 其 中 SYBR 荧 光 染 料 12.5 μL, 10 μmol/mL上下游引物 ( 表 1) 各 1 μL,cDNA (1 μg/mL) 模板 1.5 μL, 补 充 ddH2O 10 μL, 每一样本设 3 个复孔。 95 ℃、 3 min 变性后, 共进行40 个 循 环 扩 增, 每 一 个 循 环 包 括 95 ℃ 、 10 s, 61 ℃、 50 s。 从 65 ℃ 到 95 ℃, 每隔 0.5 ℃ 保 持5 s, 记录一次荧光 值, 获 得 溶 解 曲 线。 所有 样 品检测均设置阴性对照 (无模板) 以排除假阳性。

相对定量的计算方法:mRNA表达量变化 = 2-ΔΔCt, 其中 ΔΔCt=(处理样本目的基因 Ct-处理样本内参基因 Ct)-(对照样本目的基因 Ct-对照样本内参基因 Ct)。

表1 不同基因的引物序列Tab.1 Prim er sequences of the differen t genes

2.5 统计学分析 每组实验重复 3 次, 采用 Prism软件对数据进行两因素方差分析和显著性检验；多组间参数采用单因素方差分析和多重比较。

3 结果与讨论

3.1 大蒜素及其前药对食管癌细胞的增殖抑制作用 以 4.8 μg/mL二烯丙基二硫化物 (DADS) 为对照,用不同质量浓度的大蒜素和大蒜素前药处理Eca9706 细胞 24、 48 和 72 h,MTT比 色 法 测 定 细胞的增殖抑制率 (图 2A,2B)。 大蒜素及其前药处理24 和 48 h 均呈现出时间和剂量依赖性抑制食管癌细胞的增殖,而较高质量浓度的大蒜素及其前药 (20、 30 μg/mL) 处 理 72 h 未 表 现 出 剂 量 依赖, 这是由于增殖抑制率已达到较高水平 (94%以上) 而滞长。 大蒜素及其前药抑制 Eca9706 细胞增殖的最佳作用质量浓度为 20 μg/mL, 最佳作用时 间 为 48 h, 其 抑 制 率 分 别 达 到 94.5% 和 96.7%。 20 μg/mL大蒜素及其前药作用食管癌的抑制率 (48 和 72 h) 与 4.8 μg/mL DADS 接 近 。大蒜素前 药 处 理 Eca9706 细 胞 24 和 48 h 的 IC50均小于大蒜素 (表 2), 大蒜素前药处理 24 h 的 IC50比大蒜素降低了 46%。 说明大蒜素前药抑制食管癌细胞的效果优于大蒜素。

图 2 大蒜素及其前药对 Eca9706 细胞的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of allicin and its prodrug on Eca9706 cells

表 2 大 蒜素及 其 前 药 作 用 （20 μg/m L） Eca9706 细 胞 不同时间的 IC50值Tab.2 IC50of allicin and its prodrug （20 μg/m L） on Eca 9706 cells at different tim es

3.2 大蒜素及其前药对食管癌细胞 p53 基因表达的影响 p53 基因的突变和高表达是多种癌症发生的重要因素, 突变型的 p53 通过上调 bcl-2 和下调bax基因表达, 阻止细胞色素 c从线粒体中的释放,最终抑制癌细胞凋亡。本实验结果显示,低、中、 高质量浓度大蒜素及其前药处理 Eca9706 细胞不同时间后,p53 表达量均显著低于对照组 (表3)。 与对照组相比, 低、 中、 高质量浓度大蒜素及其前药处理 72 h 后 p53 基因表 达 量 分别下降了24.2%、 56.3%、 82.6% 和 43.9%、 65.1%、73.9%, 呈现出剂量依赖性。大蒜素及其前药能导致 Eca9706 细胞中的 p53 基因下调, 进而影响凋亡 相关基因的表达, 最终可引起食管癌细胞凋亡。

表 3 大蒜素及其前药处理 Eca9706 细胞后 p53 基因转录水平的变化 （）Tab.3 Variety of p53 m RNA expression after Eca9706 cells treated w ith allicin and its prod rug （）

表 3 大蒜素及其前药处理 Eca9706 细胞后 p53 基因转录水平的变化 （）Tab.3 Variety of p53 m RNA expression after Eca9706 cells treated w ith allicin and its prod rug （）

注: 与对照组比较,*P＜0.05,**P＜0.01

质量浓度/ (μg.m L-1) p53 mRNA大蒜素组大蒜素前药组24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 0 0.98 ±0.04 0.92 ±0.04 1 1.04 ±0.03 0.99 ±0.03 10 0.50 ±0.18* 0.50 ±0.12* 0.70 ±0.02 0.87 ±0.02 0.80 ±0.01* 0.56 ±0.04*20 0.36 ±0.02** 0.44 ±0.03** 0.40 ±0.03** 0.50 ±0.04* 0.62 ±0.08** 0.35 ±0.05**40 0.31 ±0.11** 0.42 ±0.06** 0.16 ±0.03** 0.55 ±0.06* 0.21 ±0.06** 0.26 ±0.05 1 **

3.3 大蒜素及其前药对食管癌细胞 survivin 基因表达的影响 Survivin 是一种凋亡抑制基因, 过度表达使细胞失去了正常增生周期中凋亡 “开关”的限制,造成细胞增殖增加,凋亡减少,导致癌症的发生。不同质量浓度的大蒜素及其前药处理Eca9706 细胞不同时间,survivin 的表达量与对照组相比均有所下降 (表 4), 说明大蒜素及其前药在转录水平上抑制了 Eca9706 细胞 survivin 的 mRNA表达,起到诱导癌细胞凋亡的作用。高质量浓度的大蒜素及其前药 处理 72 h,survivin 表达量显著降低,诱导癌细胞凋亡的作用较强,并且大蒜素前药的效果优于大蒜素。

表 4 大蒜素及其前药处理 Eca9706 细胞后 survivin基因转录水平的变化 （）Tab.4 Variety of survivin mRNA expression after Eca9706 cells treated with allicin and its prodrug （）

表 4 大蒜素及其前药处理 Eca9706 细胞后 survivin基因转录水平的变化 （）Tab.4 Variety of survivin mRNA expression after Eca9706 cells treated with allicin and its prodrug （）

注: 与对照组比较,*P＜0.05,**P＜0.01

质量浓度/ (μg.m L-1) survivin mRNA大蒜素组大蒜素前药组24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 0 0.85 ±0.06 0.83 ±0.10 1 0.83 ±0.01 0.72 ±0.13 10 0.84 ±0.13 0.75 ±0.09 0.43 ±0.02* 0.91 ±0.07 0.66 ±0.02 0.18 ±0.04**20 0.74 ±0.10 0.58 ±0.06 0.41 ±0.02** 0.64 ±0.05** 0.73 ±0.06 0.10 ±0.01**40 0.72 ±0.08 0.29 ±0.03** 0.18 ±0.02** 0.38 ±0.04** 0.41 ±0.04** 0.02 ±0.00 1 **

3.4 大蒜素及其前药对食管癌细胞 bcl-2 和 bax基因表达的影响 bcl-2 基因是一种原癌基因, 它具有抑制细胞凋亡的作用。与对照组相比,不同质量浓度的大蒜素及其前药处理 Eca9706 细胞不同时间,bcl-2 基因表达均呈现下调 (表 5)。中、 高质量浓度的大蒜素及其前药处理 24 和 72 h,bcl-2 基因表达下调较显著, 说明它们能够通过下调 bcl-2基因表达促进 Eca9706 细胞凋亡。 bax为诱导凋亡基因,bax基因的高表达促进细胞凋亡。与对照组相比, 不同质量浓度的大蒜素处理 24 h,bax基因上调表达极显著 (表6), 前药组呈现一定程度的上调, 处 理 48 和 72 h bax基 因 表 达 上 调 不 显 著,有些处理还表现出一定程度的下降。

bcl-2 家族成员的构成比例是凋亡调控的关键因素, 其中 bcl-2/bax比率 是启动细胞凋亡的 “ 分子开关”, 当 bcl-2/bax比率降低可诱导细胞凋亡。与对照组相比,不同质量浓度的大蒜素及其前药处理 Eca9706 细胞不同时间,bcl-2/bax比率均下降(表7)。 低、 中、高质量浓度的大蒜素及其前药处理 Eca9706 细 胞 24 h,bcl-2/bax比 率 下 降 显 著,分别 比 对 照 下 降了 76%、 89%、 93% 和 61%、69%、 78%。 大蒜素及其前药可能通过调控 bcl-2/bax比率诱导食管癌细胞凋亡。

表 5 大蒜素及其前药处理 Eca9706 细胞后 bcl-2 基因转录水平的变化）Tab.5 Variety of bcl-2mRNA expression after Eca9706 cells treated with allicin and its prodrug （）

表 5 大蒜素及其前药处理 Eca9706 细胞后 bcl-2 基因转录水平的变化）Tab.5 Variety of bcl-2mRNA expression after Eca9706 cells treated with allicin and its prodrug （）

注: 与对照组比较,*P＜0.05,**P＜0.01

质量浓度/ (μg.m L-1) bcl-2 mRNA大蒜素组大蒜素前药组24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 0 0.93 ±0.03 0.92 ±0.06 1 0.87 ±0.22 0.63 ±0.06 10 0.81 ±0.04 0.58 ±0.10 0.62 ±0.14 0.7 ±0.06 0.66 ±0.01 0.32 ±0.15 20 0.42 ±0.02* 0.56 ±0.01 0.26 ±0.07** 0.59 ±0.01* 0.54 ±0.02 0.26 ±0.11*40 0.32 ±0.03** 0.49 ±0.08* 0.07 ±0.01** 0.54 ±0.20* 0.49 ±0.03 0.15 ±0.07 1 *

表 6 大蒜素及其前药处理 Eca9706 细胞后 bax 基因转录水平变化 （）Tab.6 Variety of bax m RNA expression after Eca9706 cells treated w ith allicin and its prod rug （）

表 6 大蒜素及其前药处理 Eca9706 细胞后 bax 基因转录水平变化 （）Tab.6 Variety of bax m RNA expression after Eca9706 cells treated w ith allicin and its prod rug （）

注: 与对照组比较,*P＜0.05,**P＜0.01

质量浓度/ (μg.mL-1) baxmRNA大蒜素组大蒜素前药组24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 0 3.58 ±0.50 2.10 ±0.41 1 2.54 ±0.11 1.68 ±0.17 10 3.73 ±0.7** 3.00 ±0.48 2.55 ±0.11 1.88 ±0.19 2.61 ±0.10 1.85 ±0.05 20 4.02 ±0.82** 3.78 ±0.81 2.81 ±0.73 2.26 ±0.52 2.90 ±0.72 1.82 ±0.22 40 4.58 ±0.78**1 2.93 ±0.14 1.77 ±0.30 2.40 ±0.59 3.98 ±0.57 3.13 ±1.14

表 7 大蒜素及其前药处理 Eca9706 细胞后 bcl-2/bax 比率的变化 （））Tab.7 Variety of bcl-2/bax rate after Eca9706 cells treated w ith allicin and its prodrug （

表 7 大蒜素及其前药处理 Eca9706 细胞后 bcl-2/bax 比率的变化 （））Tab.7 Variety of bcl-2/bax rate after Eca9706 cells treated w ith allicin and its prodrug （

注: 与对照组比较,*P＜0.05,**P＜0.01

质量浓度/ (μg.m L-1) bcl-2/bax大蒜素组大蒜素前药组24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 0 0.27 ±0.04 0.46 ±0.06 1 0.34 ±0.08 0.39 ±0.06 10 0.24 ±0.05** 0.21 ±0.06 0.25 ±0.06* 0.38 ±0.06** 0.25 ±0.01 0.17 ±0.08*20 0.11 ±0.01** 0.20 ±0.13 0.09 ±0.03** 0.31 ±0.09** 0.21 ±0.05 0.14 ±0.05*40 0.07 ±0.01** 0.17 ±0.02* 0.04 ±0.00** 0.21 ±0.02** 0.13 ±0.01* 0.05 ±0.01 1 **

3.5 大蒜素前药对食管癌细胞 caspase-3 基因表达的影响 半胱天冬酶 (caspase) 家族在介导细胞凋亡的过程中起着极其重要的作用,caspase-3 是caspase级联 “瀑布” 下游凋亡程序的中心, 阻断caspase-3 的激活是许多药物发挥细胞保护作用的关键机 制 之 一［15-16］。 不 同 质 量 浓 度 的 大 蒜 素 及 其前药处理 Eca9706 细胞不同时间后,caspase-3 表达均高于对照组 (表8), 并表现出剂量依赖性。中、高质量浓度的大蒜素及其 前药处 理 24 和 48 h 时, caspase-3 表达量升高显著 (P＜0.05)。 大蒜素及其 前 药 诱 导 caspase-3 高 表 达 的 质 量 浓 度 为40 μg/mL, 最佳时间为 48 h。 这 些 结果表明 大 蒜素及其前药能够通过上调 caspase-3 的表达, 激活下游凋亡程序,促进食管癌细胞凋亡。

表 8 大蒜素及其前药处理 Eca9706 细胞后 caspase-3 基因转录水平的变化 （））Tab.8 Variety of caspase-3mRNA exp ression after Eca9706 cells treated with allicin and its prodrug （

表 8 大蒜素及其前药处理 Eca9706 细胞后 caspase-3 基因转录水平的变化 （））Tab.8 Variety of caspase-3mRNA exp ression after Eca9706 cells treated with allicin and its prodrug （

注: 与对照组比较,*P＜0.05,**P＜0.01

质量浓度/ (μg.mL-1) caspase-3 mRNA大蒜素组大蒜素前药组24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 0 1.11 ±0.03 1.58 ±0.41 1 1.14 ±0.08 1.25 ±0.07 10 2.50 ±0.02 2.87 ±0.16 3.52 ±0.12** 1.47 ±0.28 2.08 ±0.04 1.80 ±0.43 20 4.66 ±0.04** 5.81 ±0.35** 4.91 ±0.07** 3.36 ±0.10** 4.94 ±0.27** 2.11 ±0.43 40 4.82 ±0.23** 6.78 ±0.09** 4.40 ±0.01** 4.6 ±0.15** 6.00 ±1.40** 3.22 ±0.45 1 *

4 讨论

细胞增殖的失控是肿瘤细胞的基本生物学特征之一,大量的研究表明大蒜素能够抑制多种癌细胞的增殖,Oommen 等 人［17］的 研 究 表 明, 鼠 纤 维 肉瘤细胞 L-929、 人结肠癌细胞 SW480 和人宫颈癌细胞 HeLa随着大蒜素的质量浓度增加存活率降低。大蒜素呈剂量依赖性抑制胃癌 SGC-7901 细胞, 高质量浓度 的 大 蒜 素 (0.1 mg/mL) 处 理 48 h 抑 制率达到 89%［4］。 本实验也证实了大蒜素及其前药显著抑制食管癌细胞增殖,在大蒜素及其前药质量浓度为 20 μg/mL, 处 理 时 间 为 48 h, 其 抑 制 率 分别达到 94.5%和 96.7%。 不同时间和剂量处理食管癌细胞均呈现出时间和剂量依赖型抑制癌细胞的增殖。 大蒜 素 前 药 处 理食 管 癌 细胞 (24 和 48 h)的 IC50小于大蒜 素 ( 表 1), 说 明 前 药抑制食 管 癌细胞的效果优于大蒜素,这可能与前药相对于大蒜素较稳定有关。

肿瘤的发生是多基因参与的复杂过程,涉及多个癌基因和抑癌基因的激活与失活。大蒜素能够诱导前列 腺 癌 LNCaP细 胞［18］、 小 鼠 黑 色 素 瘤 细 胞B16-F1［19］、 人胃 腺 癌 SGC-7901 细 胞 株［20］等 癌 细胞的凋亡。大蒜素诱导肿瘤细胞凋亡涉及到多种蛋白的作用, 包括 bcl-2 家族、 caspase家族、 p53 和survivin 等。 野生型的 p53 是一种抑癌基因, 在细胞增殖、 分化、 DNA修复、 细胞周期和凋亡中起重要的作用［21］。 p53 基因 突 变 失去 了 对 细胞 增 殖的抑制,而且出现类似癌基因蛋白类的促细胞恶性转化的作用, 在多种肿瘤细胞中都发现 p53 基因的突变或缺失［22］。 癌 细 胞 中的突变 型 p53 通 过 上 调凋亡抑制基因 bcl-2, 下调凋亡促进基因 bax, 抑制癌细胞的凋亡。 survivin 基因是一个被野生型 p53基因抑制的基因, 由于癌细胞中 p53 基因的突变,丧失了对 survivin 基因转录的抑制作用, 从而促进suvivin 基 因 的 异 常 表 达［23-24］。 survivin 与 p53 在 喉癌组织中的表达呈显著正相关［25］。 survivin 可 以抑制细胞凋亡的执行者 caspase-3 的活性, 阻断各种刺激诱导的细胞 凋 亡 过 程［26］。 已 有 的 研 究 发 现 在喉癌和肝癌组织中 survivin 与 caspase-3 的表达呈明显负相关［25,27］。许 多 研 究表明大 蒜 素 及大蒜中的有机硫化合物诱导多种癌细胞凋亡的机制,主要表现在能下调 p53、 bcl-2 表达, 上调 bax和 caspase-3基因表达,bax/bcl-2 基因表达比率上升, 最终导致癌细 胞 凋 亡［28-35］。 本 实 验 结 果 证 实 了 大 蒜 素 及其前药 能 够 上 调 Eca9706 细 胞 中 bax和 caspase-3 mRNA表达, 下调 p53、 bcl-2 和 survivin mRNA表达。 大蒜素及其前药诱导 Eca9706 细胞凋亡的机理可能是通过线粒体途径实现, 首先突变型 p53 基因表达下调, 抑制 bcl-2 和促进 bax基因的表达； 其次突变型 p53 基因作为 survivin 的负调控因子下调其表达； 最终由于 survivin 基因表达的下调, 促进了 caspase-3 基因表达, 它们之间的协同作用导致食管癌细胞凋亡。

综上所述,大蒜素及其前药能通过调控凋亡相关基因,抑制食管癌细胞增殖,诱导食管癌细胞凋亡。大蒜素前药比大蒜素稳定,有望成为控制肿瘤生长的天然理想药物。

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A llicin and its prodrug inhibit proliferation and apoptosis gene expression in human esophageal cancer Eca9706 cells

CHANG Quan-e, GOU Ping*
(College of Life Scienceand Technology,Xinjiang University,Urumuqi830046,China)

AIM To study the inhibitory effect of allicin and its prodrug(alliin+alliinase)on proliferation and apoptosis gene expression of human esophageal cancer Eca 9706 cells.METHODS The proliferation inhibition and apoptotic gene expression of esophageal cancer cells treated with allicin and its prodrug were assayed by MTT and real-time quantitative RT-PCR,respectively.RESULTS Allicin and its prodrug inhibited cancer cells proliferation in a dose-and time-dependentmanner,and the inhibitory effectof the latterwas better than thatof the former.Real-time RT-PCR showed that allicin and its prodrug upregulatedmRNA expression of bax and caspase-3 genes of esophageal cancer cells,and downregulated mRNA expression of survivin,mutant p53,and bcl-2 genes. CONCLUSION The inhibition of cancer cells'proliferation and induction of apoptosis caused by allicin and its prodrug may be related to the mitochondrial pathway.

allicin； allicin prodrug； human esophageal cancer cells；proliferation； apoptosis

R966

:A

:1001-1528(2014)06-1117-08

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.06.002

2013-06-12

新疆自治区高校科研计划 (XJEDU2010I13)

常全娥 (1987—), 女, 硕士, 研究方向: 生物化学。 E-mail:cqe1987@163.com

*通信作者: 苟 萍 (1955—), 女, 教授, 研究方向: 生物化学。 E-mail:gou-ping@sina.com.cn