四种方法对不同MCV水平血小板计数的影响

郑玉芬 卢国光 吴春龙 褚邦勇

（浙江省台州医院，浙江临海 317000）

·临床研究·

四种方法对不同MCV水平血小板计数的影响

郑玉芬 卢国光 吴春龙 褚邦勇

（浙江省台州医院，浙江临海 317000）

目的探讨采用不同的方法进行血小板（PLT）计数时分析平均血细胞比容（MCV）对计数结果产生的影响。方法依据Sysmex XE－2100血细胞分析仪测得MCV值将668例标本分为MCV＞80fl、≥70～80 fl、≥60～70 fl、＜60 fl，根据PLT计数又分为，PLT≤30×109／L、（31～125）×109／L、（126～350）×109／L和＞350×109／L四组。采用Sysmex XE－2100血细胞分析仪的光学法（PLT－O）、电阻抗法（PLT－I）和Coulter LH－750血细胞分析仪的拟合曲线法以及手工计数法对MCV处于不同范围内的668例标本进行PLT计数，并以流式细胞仪法（FCM）检测PLT计数结果为标准，将以上五种方法所得PLT计数结果互相比较，进行分析。结果当MCV＞80fl时，PLT无论低值还是高值，PLT－I、拟合曲线法PLT计数结果与FCM法PLT计数结果差异均无统计学意义（P＞0.05）；当MCV≥70～80fl时，低值PLT的PLT－I、拟合曲线法PLT计数结果与FCM法PLT计数结果之间差异有统计学意义（P＜0.05），而PLT＞30×109／L的各组PLT－I、拟合曲线法PLT计数结果与FCM法PLT计数结果之间差异无统计学意义（P＞0.05）；当MCV≥60～70 fl时，只有高值的PLT（＞350×109／L）在PLT－I、拟合曲线法PLT计数结果与FCM法PLT计数差异无统计学意义（P＞0.05），包括低值PLT的其余各组PLT－I、拟合曲线法PLT计数结果与FCM法PLT计数结果之间差异均有统计学意义（P＜0.05）；当MCV＜60fl时，无论高值PLT还是低值PLT，PLT－I、拟合曲线法PLT计数结果与FCM法PLT计数均有统计学意义（均P＜0.05）。结论在使用PLT－I、拟合曲线法做PLT计数时，如MCV＜70fl，PLT计数会增高，而使用PLT－O、手工法做PLT计数时MCV对计数结果无显著性影响。当MCV＜70fl时且PLT直方图异常的标本应采用PLT－O和（或）手工法复查PLT计数结果；且对于低值PLT（PLT≤30×109／L），当MCV≥70～80fl时PLT计数结果就会出现假性增高。

平均血细胞比容；PLT计数；光学法；电阻抗法；拟合曲线法；手工计数法

各种血液分析仪对血小板（PLT）的检测多采用电阻抗原理，虽然在对正常标本进行检测时其PLT计数结果比较可靠，但当标本有小红细胞出现和（或）红细胞碎片较多时，PLT和小红细胞及红细胞碎片的大小分布出现交叠，对PLT计数结果就会出现影响，这是受自身检测原理限制的结果。本研究以流式细胞仪PLT计数的参考方法为基准，以手工计数及涂片观察PLT及红细胞形态为辅助手段，着重探讨平均血细胞比容（MCV）处于不同范围的血标本中PLT－I法、PLT－O法及拟合曲线法对PLT检测结果的影响。

1 标 本

收集本院2013年2～9月门诊血常规668份，其中男320份，女348份。所有血液标本采集后室温（18～22℃）放置，4小时内完成各种PLT计数方法对标本的平行测定。

2 方 法

2.1 分组 目前已有文献报道MCV≥80fl（正常参考值下限）对PLT计数无明显影响，而＜60fl对PLT计数影响较大。本研究以10fl为单位逐渐递减，并根据Sysmex XE－2100全自动血液分析仪所测MCV数据分为4组：MCV＜60fl共108例，MCV≥60～70fl共172例，MCV≥70～80fl共184例，MCV＞80fl共204例。每组又依据Sysmex XE－2100所测的PLT结果分为增高组：PLT＞350×109／L；正常范围组：PLT＞（125～350）×109／L；减少组：PLT＞（30～125）×109／L；严重出血组：PLT＜30×109／L。

2.2 仪器与试剂 Sysmex公司生产的XE－2100全自动血液分析仪和SP－1000i自动推片机（瑞氏－姬姆萨染色法）；贝克曼公司生产的Coulter LH－750血液分析仪以及美国BD流式细胞仪及其相应配套试剂，仪器均用配套校准品对其进行校准，标本测定前做质控品，确认仪器处于正常工作状态，严格遵照仪器操作规程。Lecia显微镜购于南京高清智能有限公司，XB－K－25型血球计数板由上海安信光学仪器制造有限公司生产，EDTA－K2抗凝管由浙江拱东医疗科技有限公司提供。PLT稀释液（草酸铵法稀释液）按《全国临床检验操作规程》［1］第3版配制，于4℃冰箱保存［2］。

2.3 检测方法 （1）仪器检测法：所有仪器均用配套校准品对其进行校准，标本测定前做质控品，确认仪器处于正常状态，严格遵照仪器操作规程的要求，分别记录数据，4小时内测定完毕。Sysmex XE－2100全自动血液分析仪和Coulter LH－750血液分析仪的PLT计数比对检测误差＜1／3 CLIA′88。Sysmex XE－2100全自动血液分析仪的计数和细胞分类（CBC＋DIFF）通道及网织红细胞／PLT－光学法（RET）通道检测，记录PLT－I及PLT－O数值；Coulter LH－750血液分析仪计数和细胞分类（CBC＋DIFF）模式检测，记录PLT值。BD流式细胞仪采用2002年ICSH／ISLH所推荐的“使用单克隆抗体（CD41／CD61）的流式细胞术”，在流式细胞仪上检测得出PLT和红细胞比值，将比值与参考方法测定的红细胞数计算后得出准确的PLT值［3］。（2）手工计数法：将668例血常规标本使用Sysmex公司生产的SP－1000i自动推片机（瑞氏－姬姆萨染色法）制血涂片染色（保证良好的涂片及染色效果）显微镜油镜下观察100个视野，剔除PLT聚集或形态异常的标本，由2名技术熟练的主管技师采用双盲法手工计数PLT，取2次计数结果的均值（2次误差控制在5%以内），手工计数严格按《全国检验技术操作规程（第3版）》［1］操作。

2.4 统计学处理 使用SPSS 11.5统计软件，将各组仪器各种方法所测得的PLT值，即PLT－I法、PLT－O法、拟合曲线法、手工计数法分别与FCM法得出的标准PLT值采用配对t检验进行比较。

3 结 果

3.1 不同方法的PLT计数 表1与表2中除了MCV≥70～80fl样本中PLT≤30×109／L组PLT－I、拟合曲线法与FCM法PLT计数结果之间差异有统计学意义（P＜0.05）外，其余各组各方法与FCM法PLT计数差异均无统计学意义（均P＞0.05）；表3与表4中除了MCV≥60～70fl样本中PLT＞350× 109／L组各方法与FCM法结果之间差异无统计学意义外（P＞0.05），其余各组PLT－I法、拟合曲线法与FCM法结果之间差异均有统计学意义（均P＜0.05）。各不同MCV水平间PLT－O法、手工法与FCM法之间差异均无统计学意义（均P＞0.05）。详见表l～4。

表1 5种方法对MCV＞80fl样本PLT检测结果分析（×109／L，±s）

表1 5种方法对MCV＞80fl样本PLT检测结果分析（×109／L，±s）

表2 5种方法对MCV≥70～80fl样本PLT检测结果分析（×109／L±s）

表2 5种方法对MCV≥70～80fl样本PLT检测结果分析（×109／L±s）

表3 5种方法对MCV≥60～70fl样本PLT检测结果分析（×109／L，±s）

表3 5种方法对MCV≥60～70fl样本PLT检测结果分析（×109／L，±s）

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表4 5种方法对MCV＜60fl样本PLT检测结果分析（×109／L，±s）

表4 5种方法对MCV＜60fl样本PLT检测结果分析（×109／L，±s）

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3.2 各组不同方法PLT计数与FCM法PLT计数的配对t检验结果。详见表5。

表5 四种方法与FCM法检测PLT的配对t 检验结果

4 讨 论

血细胞分析仪器法计数PLT有着速度快、重复性好、准确度高等优点，成为日常工作中的首选方法。但现有仪器大多为RBC、PLT在同一个通道同时测定，若标本中存在小红细胞或其碎片、大PLT、聚集的PLT等情况时就会干扰仪器法计数结果。本实验针对不同的MCV，以PLT计数参考方法为标准，探讨各方法检测的PLT的准确性。

PLT电阻抗法是通过细胞通过微孔时产生的瞬间电流变化，通过细胞的大小来识别细胞［4］，所以当血中出现一些大小近似PLT的小红细胞时，这些小红细胞就会被当作PLT加以计数，尽管仪器具有浮动界标（PLT－I）和拟合曲线（Coulter LH－750）的功能［5］，但由于血液中红细胞数量远远大于PLT数量，即使有少部分小红细胞混入PLT计数范围内，也会给PLT数造成很大的影响，从而使PLT计数假性增多。

光学法（PLT－O）是通过Plymethine和Oxazine对PLT核酸荧光染色，采用前向散射光和侧向荧光对PLT内部DNA和RNA成分进行鉴别计数，因此PLT－O在一定程度上改善了电阻抗法原理仅依靠PLT体积测定所带来的局限性，能有效地鉴别小红细胞、红细胞碎片和大PLT，从而排除干扰，得到更可靠的PLT结果［6］。本文结果显示4组标本中PLT－O法检测结果与FCM法及手工法之间差异均无统计学意义（P＞0.05）。

FCM法采用EDTA抗凝全血加特异性荧光单克隆抗体（CD41和CD61）染色PLT，被染色的PLT在流式细胞仪上根据荧光强度、侧向角和前向角散射光对数放大，设置红细胞和PLT门，细胞获取率＜3000个／s，共收集60000个以上细胞，1000个以上PLT，统计RBC／PLT－R，根据每微升血中RBC－C和RBC／PLT－R，按公式PLT／μl＝RBC－C／（RBC／PLT－R）就可以算出PLT，精密度达2%，远高于显微镜5%的精密度（在计数池中只计数500个PLT时）［7］。此法测PLT可以排除“非PLT颗粒”和人工计数误差的干扰，从而更准确计数PLT，因此该检测方法在2001年被ICSH推荐为PLT计数的参考方法。

低值PLT是临床一个重要的危急值，与血栓性和出血性疾病息息相关，其准确性对于诊治起着决定性作用。而由于血液中红细胞数量远远大于PLT数量，即使仅有极少量小红细胞混入PLT计数范围内，也会给PLT计数数造成很大的影响，由于低值PLT（≤30×109／L）基数较低，这种影响又显得尤为明显。表5总结出，当MCV＞80fl时，PLT无论低值还是高值，PLT－I、拟合曲线法PLT计数结果与FCM法PLT计数结果差异均无统计学意义（P＞0.05）；当MCV≥70～80fl时，低值PLT的PLT－I、拟合曲线法PLT计数结果与FCM法PLT计数结果之间差异有统计学意义（P＜0.05），而PLT＞30×109／L的各组PLT－I、拟合曲线法PLT计数结果与FCM法PLT计数结果之间差异无统计学意义（P＞0.05）；当MCV≥60～70 fl时，只有高值的PLT（＞350×109／L）在PLT－I、拟合曲线法PLT计数结果与FCM法PLT计数差异无统计学意义（P＞0.05），包括低值PLT的其余各组PLT－I、拟合曲线法PLT计数结果与FCM法PLT计数结果之间差异均有统计学意义（P＜0.05）；当MCV＜60fl时，无论高值PLT还是低值PLT，PLT－I、拟合曲线法PLT计数结果与FCM法PLT计数均有统计学意义（均P＜0.05）。

实验中所有的标本已通过涂片染色镜检的方法将有PLT聚集或形态异常的标本剔除，且手工计数时由2名技术熟练的主管技师采用双盲法手工计数PLT，取2次计数结果的均值（2次误差控制在5%以内），PLT手工法结果较接近FCM法计数结果。本文结果显示手工法PLT计数结果在4组标本中与FCM法之间差异均无显著性意义（P＞0.05）。

总之，当PLT－I法检测血常规时若测得MCV＜70fl和（或）有PLT直方图异常时可选择PLT－O法、FCM法或手工法进行复查；而对于低值PLT（≤30×109／L），应该视MCV情况，当MCV＜80fl时就应采用PLT－O法、FCM法或手工法进行复查。而在检验科日常工作中FCM法虽然计数可靠，但其仍存在一些不足之处，如仪器价格高昂，检测费用高，操作复杂，为了避免在体外活化，血样需要在45分钟内处理，不能久置，也不能广泛应用于临床标本的检测；而手工法费时费力，且存在计数者主观因素、计数池冲池分布不均等原因的影响其结果准确性、重复性较差，不适合大量临床标本的复查。因此，PLT－O法是解决异常血液标本检测PLT数的一个准确而客观的重要手段，充分发挥仪器的优越性，准确测量PLT值，为临床提供可靠的诊疗依据具有重要的意义。

［1］叶应妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程．3版，南京：东南大学出版社，2006：136

［2］International Council for Standardization in Haematology Expert Panel on Cytometry．International Society of Laboratory Hematology Task Force on Platelet Counting．Platelet counting by the RBC／platelet Ratio Method．A refefence Method．Am J Clin Pathol，200l，115：460

［3］Vander Meer W，MacKenzie M A．Dinnissen J W，et al．Pseudoplatelets：A etrospective study of their incidence andinterference with platelet counting．J Clin Pathal，2003，56：772

［4］张蕾，李智，李泳，等．ABBOTT CD－3700全自动血液分析仪对低值PLT检测准确度探讨．检验医学，2008，23（6）：563

［5］丛玉隆．当代血液分析技术与临床．北京：人民卫生出版社，1997．34

［6］Field D，Taube E，Heumann S．Performance evaluation of the im－mature granulocyte parameter on the Sysmex XE－2100 automatedhematology analyzer．Lab Hematol，2006，12（1）：11

［7］Molloy P L．Electrophoretic mobility shift assays．Methods Mol Bi－ol，2000，130：235

*为通讯作者，E－mail：chuby＠enzemed.com