水合氯醛合剂微生物限度检查的验证

杜建红 张国庆 方晨 祝辉 刘徽

（成都军区联勤部药品仪器检验所，四川成都 610017）

水合氯醛合剂微生物限度检查的验证

杜建红 张国庆 方晨 祝辉 刘徽

（成都军区联勤部药品仪器检验所，四川成都 610017）

目的：建立水合氯醛合剂的微生物限度检查法。方法：按《中国药典》（2010年版）二部附录XI J“微生物限度检查法”分别采用常规法、培养基稀释法进行水合氯醛合剂的微生物限度检查验证试验。结果：供试品对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的人工染菌回收率均高于70%，可用常规法进行细菌计数。对白色念珠菌和黑曲霉的人工染菌回收率高于70%，霉菌和酵母菌计数均可用培养基稀释法。控制菌采用常规法验证检出阳性菌，阴性菌未检出。结论：本品可采用常规法与培养基稀释法结合进行水合氯醛合剂的微生物限度检查。

水合氯醛合剂；微生物限度检查；常规法；培养基稀释法；验证

水合氯醛合剂为《中国人民解放军医疗机构制剂规范》[1]（2002年版）所收载的内服制剂，具有镇静、催眠和抗惊厥作用，用于精神紧张、烦躁不安引起的失眠及惊厥。《中国人民解放军医疗机构制剂规范》2002年版[1]未给出确切的微生物限度检查方法，因此依据《中国药典》（2010年版）二部[2]的附录 XI J《微生物限度检查法》中方法验证试验的要求，对本品建立微生物限度检查方法并进行方法学验证，确保方法的有效性。

1 仪器与材料

1.1 仪器

生物安全柜BSC-1000IIA2（苏州安泰空气技术有限公司）、洁净工作台SW-CJ-1FD（苏州安泰空气技术有限公司）、电热恒温培养箱DNP（上海精宏实验设备有限公司）、集菌仪HTY601(杭州泰林生物技术设备有限公司）。

1.2 实验样品

水合氯醛合剂，成都军区某医院配制，批号：20130821、20130822、20130823。

1.3 菌种

大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]，均来源于成都市食品药品检测中心，均为第4代培养物。

1.4 培养基

营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、改良马丁培养基、改良马丁琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、溴化十六烷基三甲胺琼脂培养基，以上培养基均由北京三药科技开发公司生产，按标签说明进行配制。

1.5 稀释液

0.9%无菌氯化钠溶液、0.9%无菌氯化钠溶液、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。

2 方法与结果

2.1 细菌数、霉菌及酵母菌计数方法的验证

2.1.1 常规法测定细菌、霉菌及酵母菌数的方法验证

2.1.1.1 菌液制备 取经35℃培养24 h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的营养肉汤培养基培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至约含 50～ 100 cfu/mL的菌悬液，做活菌计数备用；取经25℃培养24 h的白色念珠菌改良马丁培养基培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至约含50～ 100 cfu/mL的菌悬液，做活菌计数备用；取经25℃培养7 d的黑曲霉菌改良马丁琼脂培养基斜面培养物，加 5 mL生理盐水洗下孢子，吸出孢子悬液（用管口带有薄纱布的无菌毛细吸管吸出孢子悬液）至无菌试管中，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至约含50～100 cfu/mL的孢子悬液，做活菌计数备用。

2.1.1.2 供试液制备 取本品10 mL，加pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至 100 mL，混匀，即得1∶10供试液。

2.1.1.3 回收率测定 ①供试品对照组：取1∶10供试液1 mL，平行制备2个平板，测定供试品本底细菌数；取1∶10供试液 1 mL，平行制备 2个平板，测定供试品本底霉菌和酵母菌数。②菌液组：分别取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉5种试验菌悬液1 mL，注入平皿，每株试验菌平行制备2个平板，倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养，测定所加的试验菌数。③试验组：取1∶10供试液1 mL和大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌试验菌悬液1 mL，分别注入平皿中，倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，待凝固后，35℃培养3天，计数；取1∶10供试液1 mL和白色念珠菌、黑曲霉菌悬液 1 mL，分别注入平皿中，倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，待凝固后，25℃培养7 d，计数。

结果见表1。

表1 常规法验证细菌、霉菌及酵母菌试验结果

采用常规法检查，供试品对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的人工染菌回收率均高于70%，对白色念珠菌的人工染菌回收率高于70%，但对黑曲霉的人工染菌回收率低于70%。因此，本品细菌计数可采用常规法进行测定，霉菌及酵母菌的计数应重新选择适当的方法，消除其抑菌活性后再进行验证。

2.1.2 培养基稀释法（0.2 mL/皿）测定霉菌及酵母菌数的方法验证

2.1.2.1 菌液制备和供试品制备 同常规法。

2.1.2.2 回收率测定 ①供试品对照组：采用培养基稀释法测定供试品本底霉菌和酵母菌数。取1∶10供试液1 mL，等量分注至5个平皿（0.2 mL/皿），倾注玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后，置25℃培养 5 d，测定供试品本底霉菌和酵母菌数。②菌液组：分别取上述白色念珠菌、黑曲霉 2种菌悬液1 mL，注入平皿，每株试验菌平行制备2个平皿，倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养，测定所加的试验菌数。③试验组：分别取1∶10供试液0.4 mL，等量分注至2个平皿（0.2 mL/皿），每个平皿分别加入白色念珠菌、黑曲霉菌悬液1 mL，倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备 2个平板，待凝固后，25℃培养 7 d，计数。结果见表2。

表2 培养基稀释法（0.2 mL/皿）测定霉菌和酵母菌数试验结果

由表2可知，本品采用培养基稀释法（0.2 mL/皿）检查，供试品对白色念珠菌和黑曲霉的人工染菌回收率均高于70%，因此，本品霉菌和酵母菌计数可采用培养基稀释法（0.2 mL/皿）进行测定。

2.2 控制菌检查方法的验证

2.2.1常规法检查大肠埃希菌

2.2.1.1 供试液制备 取本品10 mL，加pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至 100 mL，混匀得1∶10供试液。

2.2.1.2 菌液制备 同2.1.1.1。

2.2.1.3 试验组 取1∶10供试液10 mL及制备好的大肠埃希菌悬液1 mL加入到100 mL的胆盐乳糖培养基中，35℃培养24 h。吸取0.2 mL培养物接种至5 mL 4-甲基伞形酮葡糖苷酸（MUG）培养基中，35℃培养，于 5，24 h在366 nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，观察颜色变化。

2.2.1.4 阴性菌对照组 取 1∶10供试液10 mL及制备好的金黄色葡萄球菌悬液1 mL分别加入到100 mL胆盐乳糖培养基中35℃培养，其他操作同 2.2.1.3。

2.2.1.5 供试品对照组 取1∶10供试液10 mL加入到100 mL胆盐乳糖培养基中35℃培养，其他操作同2.2.1.3。

大肠埃希菌检查方法验证结果见表3。

表3 大肠埃希菌检查方法（胆盐乳糖培养基：100 mL）验证结果

由表 3可知，阴性菌对照组加入金黄色葡萄球菌培养后，MUG和靛基质均呈阴性反应，而试验组检出大肠埃希菌，本品大肠埃希菌可采用常规法（培养基：100 mL）进行检查。

3 讨论

本品可采用常规法进行细菌计数，培养基稀释法进行霉菌和酵母菌计数，可采用常规法进行控制菌的检查。根据验证结果将微生物限度检查方法记录如下：取本品10 mL，加pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，混匀得1∶10供试液。细菌计数采用常规法，霉菌和酵母菌计数采用培养基稀释法（0.2 mL/皿）进行检查，控制菌采用常规法（培养基：100 mL）进行检查《中国药典》（2010年版）二部附录Ⅺ J，应符合规定。本品为《中国人民解放军医疗机构制剂规范》2002年版所收载的内服溶液剂，微生物限度检查项可参照《中国药典》（2010年版）中对口服溶液剂的标准检查。

[1] 总后卫生部.中国人民解放军医疗机构制剂规范 2002年版[S].北京：人民军医出版社,2002：附录.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（2010年版）二部[S].北京：化学工业出版社，2010：附录XI J.

Method Validation of Microbial Limit Test of Chloral Hydrate Mixture

Du Jianhong，Zhang Guoqing，Fang Chen，Zhu Hui，Liu Hui（Institute for Drug and Instrument Control of Chengdu Military Region，Sichuan Chengdu 610017，China）

Objective:To establish a method for the microbial limit test of chloral hydrate mixture.Methods:The microbial limit test on chloral hydrate mixture was validated by the routine method and membrane filtration method in accordance with the AppendixⅡof Chinese Pharmacopoeia （2010 edition）.Results:The recoveries of escherichia coli，staphylococcus aureus and bacillus subtilis by the medium dilution method were more than 70%，the routine method could be adopted for bacterial count.The recoveries of candida albicans and aspergillus niger were more than 70%，the membrane filtration method could be adopted for mould and yeast counts.The test organisms were detected in the control bacteria test by the routine method but no negative bacterial was detected.Conclusion:The routine method combined with medium dilution method can be applied for the microbial limit test of chloral hydrate mixture.

Chloral Hydrate Mixture；Microbial Limit Tests；Medium Dilution Method；Routine Method；Validation

10.3969/j.issn.1672-5433.2014.05.006

2013-12-26）

军队医疗机构制剂标准提高科研专项课题面上项目（13ZJZ04-2）

杜建红，男，副主任药师。研究方向：药物分析。通讯作者E-mail：yjsdjh@163.com