2013年美国《感染性疾病微生物学实验室诊断应用指南》简介——部分病毒综合征

宁永忠

2013年美国《感染性疾病微生物学实验室诊断应用指南》简介
——部分病毒综合征

宁永忠

本文主要介绍和讨论2013年美国感染性疾病学会和美国微生物学会联合推荐的《感染性疾病微生物学实验室诊断应用指南》中关于几种重要的病毒综合征的临床微生物学实验室检查。

微生物学；实验室；传染病；指南

2013年美国《临床感染病》杂志发表了美国感染性疾病学会和美国微生物学会联合推荐的《感染性疾病微生物学实验室诊断应用指南》[1]。该指南针对感染性疾病的实验室诊断，几乎涉及所有感染性疾病、经典病原（朊病毒和病毒、细菌、真菌、寄生虫等）和临床检查［涂片、培养、免疫学、抗原检查、核酸扩增试验（nucleic acid amplification tests,NAATs）、耐药性检查等］，并强调临床和实验室之间的合作，呼吁建立彼此间“紧密的、积极的工作关系”。本文主要介绍和讨论几种重要的病毒综合征的临床微生物学实验室检查。

1 相关内容简介

1.1 病毒综合征实验室检查要点①基于患者的年龄、免疫状态、病史和其他许多变量来考虑病毒综合征。②对多数病原因子而言，可以采集标本进行检查。需要额外检查时，可以采集额外的标本冷冻保存在实验室。对原始标本进行多种病毒的广泛检查是不符合成本-效益原则的。③标本的采集和运输是获得可信的病毒学检查结果的基本保证。应咨询微生物学实验室以确定应该采集什么样的标本，以及如何送达实验室。④很多实验室没有病毒学检查能力。标本将会送至其他实验室进行，周转时间因此会延长。⑤一些病毒因子的交叉反应会导致非特异性血清学结果。⑥免疫力检查、既往病毒感染（如组织捐献者）检查和新发感染检查可能需要不同的方式，即使考虑是同种病毒也需如此。

1.2 几种重要的病毒综合征

1.2.1 Epstein-Barr病毒（Epstein-Barr virus,EBV）感染EBV是免疫抑制患者单核细胞增多症和淋巴细胞增殖性疾病的病因。WBC数量增加伴异型淋巴细胞比例升高，常见于EBV相关单核细胞增多症。嗜异性抗体通常在症状开始后6～10 d可以检测到，病程的第2周或第3周升高，之后逐渐下降，持续1年或更长时间。假阳性结果见于白血病、胰腺肿瘤、病毒性肝炎和巨细胞病毒（cytomegalovirus,CMV）感染等。假阴性结果见于约10%的患者，尤其多见于＜10岁的儿童。

当快速单点检查（rapid Monospot）或嗜异性检查结果阴性时，应考虑其他的实验室检查（表1），以便将EBV感染与CMV、腺病毒、HIV、冈地弓浆虫等引起的单核细胞增多症样疾病区分开。此时，推荐进行针对病毒衣壳抗原（viralcapsid antigen,VCA）和EB核抗原（Epstein-Barr nuclear antigen,EBNA）的EBV IgG和IgM抗体检查。有VCA IgM（伴或不伴VCA IgG）抗体存在，而无EBNA抗体存在的情况提示近期原发性EBV感染。EBNA抗体的存在提示感染从标本采集时刻算起已超过6周，因此EBV不可能是病原。原发感染后1～2月或更长时间里会有EBNA抗体产生，终生可以检测到。90%以上的健康成年人有针对VCA和EBNA抗原的IgG类抗体，5%～10%的EBV感染者未能产生针对EBNA抗原的抗体。

表1 EBV实验室检查Table 1 Laboratory diagnosis of EBV

EBV与先天性或获得性免疫缺陷患者的淋巴细胞增殖性疾病有关，包括严重合并免疫缺陷患者、器官移植受者、外周血干细胞移植受者和HIV感染者。EBV相关淋巴细胞增殖性疾病进展前，通过NAATs可能会在外周血标本中检测到EBV载量增加；有效治疗后病毒载量会明显下降。患者的组织标本可以是单克隆、寡克隆或多克隆病变。活体组织标本中检测到EBV DNA、RNA或蛋白的存在，即可诊断为EBV相关淋巴细胞增殖性疾病。

NAATs可以用于检测AIDS相关中枢神经系统淋巴瘤时CSF中的EBV DNA，然而，EBV DNA也可见于其他异常情况（中枢神经系统弓浆虫病或化脓性脑脓肿）的CSF标本，因此其阳性是非特异性的。CSF检出抗体提示中枢神经系统感染、血液污染或抗体穿过血脑屏障。CSF/血清抗体指数的计算可能会有意义。

1.2.2 CMV感染免疫功能正常宿主疑似CMV急性感染时，推荐CMV特异性抗体检查为实验室诊断首选检查（表2）。免疫功能正常宿主中，IgM类抗体的存在意味着近期感染。但是，EBV感染或其他病因激活免疫系统后的患者会出现CMV IgM假阳性结果。只有IgG类抗体存在则意味着既往CMV暴露。

对于器官或外周血造血干细胞移植受者，NAATs检测CMV载量或抗原血症（很少有实验室检测，因为更青睐于NAATs）被用作抢先治疗（preemptive therapy）的标志物，用于诊断CMV相关症状体征，以及监测抗病毒治疗反应。用于CMV载量检查的标准参考物质（Standard Reference Material, SRM）由国家标准和技术机构提供。SRM2366含有细菌人工染色体，染色体上有CMV Towne株的基因组。SRM2366可用于评价单位体积中扩增的CMV基因组拷贝的数量（copies/ml）。

CMV可以通过外周血单个核细胞（以及其他临床标本）进行培养。但是，分离非常费力，须耗时14 d；使用小瓶培养技术（shell vial assay）可以将等待时间缩短到1～2 d。除了周转时间长外，基于培养的检查敏感性也较差。因为病毒载量典型情况下很高，而且新生儿会从尿液排出CMV，所以尿液CMV培养在一些机构一直被用于先天性CMV感染的诊断。

通过免疫组织化学或原位杂交检测，CMV抗原可以在福尔马林固定、石蜡包埋的组织标本中显示。用NAATs检测多种临床标本中的CMV DNA，有助于诊断CMV感染。

表2 CMV实验室检查Table 2 Laboratory diagnosis of CMV

免疫功能受损宿主感染CMV时，有对抗病毒药物产生耐药的潜在可能。一系列检查可以用于评估抗病毒药物的耐药性。最常用的检查是UL97（磷酸转移酶基因）测序，伴或不伴UL54（DNA聚合酶）测序。基于序列的检查可以通过临床标本DNA扩增进行，前提是标本含有足够量的CMVDNA。替代方式是，病毒可以首先通过细胞培养分离。更昔洛韦耐药多是由于UL97的点突变或缺失（膦甲酸钠、西多福韦不受影响）所致，最常见的是3个密码子（460、594、595）的突变。UL54点突变或缺失的发生较少见。如果更昔洛韦或西多福韦选择出了UL54突变，则会出现典型的对更昔洛韦和西多福韦的交叉耐药，但膦甲酸钠不受影响。如果膦甲酸钠选择出突变，通常不会出现对更昔洛韦和西多福韦的交叉耐药。

对疑似CMV中枢神经系统感染的患者，可以用NAATs检测CSF中的CMVDNA。不过，可能出现假阳性的结果（如细菌性脑膜炎患者的CMV DNA可穿过发炎的血脑屏障污染CSF）。CSF抗体检查可能意味着中枢神经系统感染、血液污染以及抗体穿过血脑屏障。CSF/血清抗体指数的计算可能会有意义。

1.2.3 单纯疱疹病毒（herpes simplex virus,HSV）感染存在HSV 1或2型糖蛋白G抗原特异性的IgG抗体，就意味着既往相应型别病毒的暴露。IgG阳性结果不能区分过去和现在的活动性感染，除非配对的急性期和恢复期标本检查显示有血清学转换。IgG水平升高4倍也提示近期暴露，不过，很多商品化试剂盒不能报告用于定量的滴度结果。存在HSV IgM抗体提示该病毒近期原发性感染。

对HSV相关皮肤或黏膜病变而言，NAATs是最敏感、最特异和最快速的检查，并可以区分HSV 1和2型（表3）。用病毒培养转运拭子用力擦拭疑似病变的皮肤和黏膜的基底部，水疱被连根去除后暴露基底。旧的、干的和结痂的病变不太可能产生阳性结果。培养和直接荧光抗体检查的敏感性低于NAATs。

表3 HSV实验室诊断Table 3 Laboratory diagnosis of HSV

CSF标本HSVNAATs检查，可以用于诊断HSV相关中枢神经系统疾病。该方法可以区分HSV 1和2型，1型最常与脑炎有关，而2型最常与脑膜炎有关。CSF病毒培养对HSV相关中枢神经系统疾病而言不够敏感。

1.2.4 麻疹病毒感染对麻疹产生免疫的个体，会产生针对病毒IgG抗体的阳性结果。未产生免疫的个体，IgG和IgM结果阴性。IgM抗体阳性而无IgG抗体，提示近期有麻疹病毒感染。出疹当天IgM通常是阳性。然而，在出疹后最初72 h内，多达20%的IgM检查可能是假阴性。因此，如果急性期IgM阴性，出疹72 h后应该采集第2份血清标本检测IgM。在出疹后1个月或更长的时间里可检测到IgM。近期接种麻疹病毒疫苗个体的IgM也可能是阳性。血清学诊断急性麻疹时需要有IgG抗体升高4倍（表4）。采集2份血清标本，第1份标本在出疹开始时尽早采集，第2份在10～30 d后采集。2份标本应采用相同的方法在当时就进行检测。确定滴度升高的标准因所用特异性试剂盒的不同而有所差别。

CSF中麻疹特异性抗体的检测可用于亚急性硬化性全脑炎（subacute sclerosing panencephalitis, SSPE）的诊断。SSPE患者CSF中麻疹抗体水平升高显著。

表4 麻疹病毒实验室诊断Table 4 Laboratory diagnosis ofmeasles virus

麻疹病毒可分离自喉部、鼻咽部或尿液中。出疹后应立即采集标本。NAATs也可考虑作为诊断试验。

1.2.5 腮腺炎病毒感染几种类型的检查可用于腮腺炎诊断（表5）。腮腺炎诊断的实验室标准包括腮腺炎病毒IgM抗体血清学检查阳性、急性期和恢复期配对血清IgG抗体水平4倍升高、临床标本分离到腮腺炎病毒或临床标本检测到腮腺炎病毒RNA。

表5 腮腺炎病毒实验室诊断Table 5 Laboratory diagnosis ofmum ps virus

急性期IgG检查的血清应在症状出现后5 d内采集（即诊断的时候）；恢复期血清应在症状出现后大约2周采集。IgM抗体典型情况下在疾病最开始的几天内可检测到，起病1周后达到高峰。应用单剂或多剂腮腺炎病毒疫苗会导致缺失的、延迟的或暂时的IgM反应。如果急性期IgM阴性，应在症状出现后2～3周采集第2份标本进行IgM检查。

对既往有免疫的疑似患者，腮腺炎病毒检查尤其是确诊病例的重要方法。病毒分离的首选标本是采自腮腺管的拭子，或采自受累的唾液腺管的拭子。腮腺炎病毒可以通过分子技术（未经美国国家食品药品监督管理局批准）检测。从腮腺炎症状出现前一直到症状出现后5～9 d，都可以检测到腮腺炎病毒RNA。

CSF抗体检查提示中枢神经系统感染、血液污染或抗体穿过血脑屏障。CSF/血清抗体指数的计算可能会有意义。

1.2.6 登革热病毒感染登革热是蚊子传播的发热性疾病。对来自特定地区的旅游者，鉴别诊断时除考虑疟疾外，还要考虑基孔肯雅病和黄热病。登革热诊断需要实验室确证，方法包括培养、NAATs或登革热特异性抗体检测（表6）。血清学检查是诊断登革热病毒感染最常见的方法。应在发热开始后5 d内采集急性期血清标本。登革热病毒感染早期阶段可能检测不到IgG抗体；IgG抗体一般情况下在症状出现后至少6 d才能产生。登革热病毒的IgG抗体可以持续几十年。对高度疑似登革热的患者，如果报告了阴性的检查结果，应在疾病开始后7～10 d再采集第2份血清标本，检测IgM和IgG抗体。登革热病毒IgM的检出提示近期感染，不过登革热病毒IgG血清学转换也可用于确诊感染。抗登革热病毒抗体检查可能会检测到针对其他黄病毒的抗体，包括西尼罗病毒和圣路易斯脑炎病毒。应特殊要求，美国国家疾病预防控制中心实验室和部分参考实验室可以进行登革热病毒分子检测。

表6 登革热病毒实验室检查Table 6 Laboratory diagnosis of dengue virus

1.2.7 腺病毒感染对无其他疾病的健康个体而言，腺病毒通常引起轻度、自限性呼吸系统疾病，多数病例仅仅通过临床资料就可进行诊断。少数情况下，宿主腺病毒感染可以致免疫功能正常尤其是患有哮喘病的儿童死亡。免疫功能受损的宿主中，腺病毒可以导致肺炎、播散性感染、胃肠炎、出血性膀胱炎、脑膜脑炎和肝炎等。

诊断可基于NAATs、培养和（或）适合的组织病理学检查（表7）。病毒培养周期长，使用小瓶培养技术会缩短时间。血浆病毒载量（通过定量NAATs评估）可用作抢先治疗的标志物，用于诊断腺病毒相关症状体征，还可用于监测一些免疫功能受损人群的抗病毒治疗反应。

血清学检查有赖于检测出针对群特异性抗原的抗体，通常须要分析急性期和恢复期的血清。中枢神经系统感染的血清学诊断基于CSF/血清抗体指数、急性期和恢复期IgG滴度4倍升高或仅IgM阳性。CSF中检测到抗体可能意味着中枢神经系统感染、血液污染或抗体穿过血脑屏障。

表7 腺病毒实验室诊断Table 7 Laboratory diagnosis of adenovirus

2 讨论

随着免疫力低下人群的增多，病毒感染性疾病在增加。EBV是免疫抑制患者单核细胞增多症和淋巴细胞增殖性疾病的病因；在免疫功能受损、造血干细胞和器官移植者中应警惕CMV感染，当免疫功能受损宿主感染CMV时，有对抗病毒药物产生耐药的潜在可能；HSV是人类感染比例最高的病毒之一，而且是病毒性脑炎的首位致病原因；麻疹病毒在中枢神经系统的感染涉及SSPE，其预后不良；近年来国际上因麻风腮疫苗不良反应问题，腮腺炎病毒成为关注热点；登革热病毒感染是热带亚热带地区经蚊传播的发热性疾病，感染严重者预后不良；腺病毒的重症感染预后不良，目前对该病毒的了解还远不够深入。临床诊断和治疗的关键依赖实验室检查，病毒培养、血清学检测及分子生物学检测均受多种因素影响，本指南对各种病毒感染性疾病的检测方法选择、标本及其运输、贮存条件给予指导，希望临床与实验室密切配合、规范操作，不断提高病毒感染性疾病的诊治能力。

[1]Baron EJ,Miller JM,Weinstein MP,etal.A guide to utilization of the microbiology laboratory for diagnosis of infectious diseases: 2013 recommendations by the Infectious Diseases Society of America(IDSA)and the American Society for Microbiology(ASM)［J］. Clin Infect Dis,2013,57(4):e22-e121.

（2013-12-04收稿 2014-01-02修回）

（责任编委 曲芬 本文编辑 王姝）

A brief introduction to a guide to utilization of them icrobiology laboratory for diagnosis of infectious diseases(2013):some viral syndromes

NING Yong-zhong
Laboratory Department,Peking University Third Hospital,Beijing 100191,China

This article focuses on themicrobiology laboratory diagnosis of some viral syndromesmentioned in a guide to utilization of themicrobiology laboratory for diagnosis of infectious diseases:2013 recommendations by the Infectious Diseases Society of America and the American Society for Microbiology.

microbiology;laboratory;communicable diseases;guidebooks

R37；R51

A

1007-8134(2014)01-0013-05

100191，北京大学第三医院检验科（宁永忠）