Survivin基因及CDK1基因联合靶向shRNA真核表达载体的构建

陈淑萍，符生苗，周红桃，蔡俊宏，李成学，王福利，许茂轩

(1.海南大学农学院，海南海口570228；2.海南省人民医院医学检验中心，海南 海口 570311；3.南方医科大学珠江医院医学检验中心，广东 广州 510280)

·论著·

Survivin基因及CDK1基因联合靶向shRNA真核表达载体的构建

陈淑萍1，符生苗2，周红桃3，蔡俊宏2，李成学2，王福利2，许茂轩1

(1.海南大学农学院，海南海口570228；2.海南省人民医院医学检验中心，海南 海口 570311；3.南方医科大学珠江医院医学检验中心，广东 广州 510280)

目的构建靶向Survivin基因及CDK1基因的短发夹样RNA(Short hairpin RNA，shRNA)真核表达载体。方法根据Genbank报道的Survivin序列及CDK1序列，遵循shRNA设计原则设计并合成各自靶向的Survivin、CDK1基因的shRNA寡核苷酸序列，构建pU6-shRNA-Survivin重组质粒、pU6-shRNA-CDK1重组质粒及pU6-shRNA-Survivin-U6-shRNA-CDK1双基因序列串联重组质粒，并进行限制性内切酶酶切及基因测序鉴定。结果经酶切及测序结果分析，pU6-shRNA-Survivin重组质粒、pU6-shRNA-CDK1重组质粒及pU6-shRNA-Survivin-U6-shRNA-CDK1双基因系列串联重组质粒均成功构建。结论成功构建Survivin基因及CDK1基因联合靶向shRNA重组质粒，为进一步研究Survivin基因和CDK1基因联合干扰提供了新的方法。

Survivin基因；CDK1基因；短发夹样RNA；pU6-M4

Survivin为耶鲁大学的Ambrosini等[1]发现的凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis，IAP)家族的一个新成员，是迄今为止发现最强的凋亡抑制因子，其功能复杂，能与数量极其众多的分子、调节因子、翻译网络、修饰因子相互作用并影响这些分子的表达与调控[2]。Survivin在肿瘤细胞中高表达，而在正常细胞中低表达，并与肿瘤患者的不良结局相关[3]，因而以Survivin为靶向的抗肿瘤研究成为近十余年来的研究热点。CDK1是细胞周期依赖性蛋白激酶(Cyclin-dependent kinases，CDKs)一个高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，也被称为p34cdc，可以对Survivin的34位点苏氨酸残基进行磷酸化，也在细胞凋亡中发挥重要作用，因此CDK1具备靶向抗肿瘤的潜质[4-5]。短发夹样RNA (Short hairpin RNA，shRNA)干扰技术可以使细胞出现靶基因沉默[6]，具有高特异性、高效性、低毒性等特点，现已广泛应用于生物医学研究的各个领域，为快速下调靶基因表达的有效手段之一。shRNA干扰技术有望成为治疗肿瘤治疗的新手段，但仍需解决诸多问题以提高疗效，其中就有通过多个基因的联合干扰的方法。本研究采用一个pU6-M4载体携带两个shRNA目的基因，构建Survivin基因及CDK1基因联合靶向shRNA真核表达载体，同时针对Survivin与CDK1的shRNA联合干扰目前还未见报道，为进一步研究Survivin基因和CDK1基因联合干扰提供了新的方法。

1 材料与方法

1.1 材料pU6-M4质粒由美国国家癌症研究所的Dolph L.Hatfield惠赠，该质粒含抗氨苄青霉素(Amp)基因、耐潮霉素(Hygro)基因及U6启动子。感受态Trans5α购自北京全式金生物技术有限公司。T4连接酶及各种限制性内切酶(BamHⅠ、HindⅢ、XhoⅠ、MfeⅠ、EcoRⅠ)均购自Fermentas公司。DNA快速凝胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒均构自QIAGEN公司。

1.2 方法

1.2.1 靶向Survivin、CDK1基因shRNA的设计根据Genbank报道的Survivin序列(NM_ 001012271，NM_001012270，NM_001168)、CDK1序列(NM_001170406，NM_001170407，NM_033379，NM_ 001786)，遵循shRNA设计原则及BLAST同源分析，再利用Ambion公司网站提供的在线软件设计出针对Survivin及CDK1共同基因编码区的shRNA寡核甘酸序列，包含发夹结构环，在首末端加上BamHⅠ/HindⅢ酶切位点，便于连接到质粒上，形成BamHⅠ+ sense+loop+anti-sense+终止信号+HindⅢ。通过预实验我们选择具有效应的shRNA-Survivin、shRNA-CDK1各两对，其正义链和反义链序列见表1。表中序列由武汉晶赛生物工程技术公司合成。

表1 shRNA-Survivin、shRNA-CDK1的模板序列

1.2.2 构建pU6-shRNA-Survivin、pU6-shRNA-CDK1重组质粒及鉴定各取1 μl正义链寡核苷酸(1.0 mg/ml)、反义链寡核苷酸(1.0 mg/ml)+18 μl× TE buffer，上PCR仪，程序为95℃，5 min，每10 s降0.1℃至室温，使两条互补单链退火为双链。用BamHⅠ、HindⅢ限制性内切酶双酶切pU6-M4质粒载体，1%琼脂糖凝胶分析酶切产物，并用Qiagen QIA快速凝胶提取试剂回收大片段。shRNA退火的寡核苷酸片段1 μl分别与线性化的pU6-M4质粒表达载体连接，室温放置20 min，然后冰上冷却2 min。取连接反应物3 μl转化感受态细胞Trans5α，分别涂布于含Amp抗性(终浓度为50 μg/ml)的LB固体平板上37℃孵育过夜。次日从每个平板挑取2～3个克隆分别接种于5 ml的含50μg/ml Amp的LB液体培养基上，37℃以200 rpm速度培养箱中过夜。由于插入的片段比较小，琼脂糖凝胶电泳较难区分，直接将菌液送去测序，使用Rev2.0(5'-AGGCGATTAAGTTGGGTA-3')引物鉴定shRNA载体序列正确。

1.2.3 pU6-shRNA-Survivin-U6-shRNA-CDK1双基因序列串联重组质粒的构建及鉴定用限制性内切酶XhoⅠ和MfeⅠ消化pU-shRNA-Survivin，用XhoⅠ和EcoRⅠ酶消化pU-shRNA-CDK1，37℃水浴孵育1 h。1%琼脂糖凝胶分析酶切产物，并用Qiagen QIA快速凝胶提取试剂回收4.9 kb大小pU-shRNA-Survivin及400 bp大小U6-shRNA-CDK1的片段，用T4连接酶连接。取连接反应物3 μl转化感受态细胞Trans5α，分别涂布于含Amp抗性(终浓度为50 μg/ml)的LB固体平板上37℃孵育过夜。次日从每个平板挑取2～3个克隆分别接种于5 ml的含50 μg/ml Amp的LB液体培养基上，37℃以200 rpm速度培养箱中过夜，提取质粒。用EcoRI和HindⅢ酶切鉴定U6-shRNA-Survivin-U6-shRNA-CDK1片段约800 bp，用HindⅢ和XhoⅠ酶切鉴定U6-shRNA-Survivin、U6-shRNA-CDK1片段各约400 bp。菌液送测序鉴定。

2 结果

2.1 pU6-shRNA-Survivin、pU6-shRNA-CDK1重组质粒的测序结果对4个重组质粒进行测序，结果显示与设计的shRNA寡核苷酸序列一致，说明pU6-shRNA-Survivin、pU6-shRNA-CDK1重组质粒构建成功(图1～4)。

2.2 pU6-shRNA-Survivin-U6-shRNA-CDK1双基因序列串联重组质粒酶切鉴定结果及测序结果根据质粒的结构及多克隆位点分析，串联重组的质粒经EcoRⅠ和HindⅢ酶切鉴定，可以切出U6-shRNA-Survivin-U6-shRNA-CDK1片段约800 bp及4.5 kb的大片段(图5)。用HindⅢ和XhoⅠ酶切鉴定，可以切出U6-shRNA-Survivin、U6-shRNA-CDK1片段各约400 bp，这两个片段重叠在400 bp处及4.5 kb的大片段(图5)。经酶切鉴定分析，pU6-shRNA-Survivin-U6-shRNA-CDK1符合酶切设计要求。测序结果显示插入的双基因序列正确。

图1 shRNA-Survivin-1寡核苷酸测序结果

图2 shRNA-Survivin-2寡核苷酸测序结果

图3 shRNA-CDK1-1寡核苷酸测序结果

图4 shRNA-CDK1-2寡核苷酸测序结果

图5 质粒酶切后的2%凝胶电泳图

3 讨论

shRNA干扰技术是将与靶mRNA配对的含有发夹状结构的RNA序列通过载体转入细胞，利用U6启动子确保shRNA表达并能传给子代细胞，shRNA在胞浆内被Dicer酶裂解成21～25个碱基对的两端有少数未配对突出碱基的干扰RNA(siRNAs)，这些siRNAs解链成单链并整合到活化的RNA诱导沉默复合物(RICS)上，整合后的siRNA碱基与靶mRNA配对，干扰靶mRNA，从而阻止其作为模板进行翻译，使细胞出现靶基因沉默现象，即出现RNA干扰效应(RNAi)[6]。RNAi虽较基因敲除效果稍差，但操作简便，有研究表明其干扰抑制效应比反义核酸技术效果好[7]，是简便快速下调靶基因表达的有效手段之一。RNA干扰技术有望成为肿瘤治疗新的手段之一，但仍需解决诸多问题以提高疗效。一方面可以通过多个基因的联合干扰以提高疗效，这得益于载体的改进，目前已有一些载体能同时携带针对多个基因或一个基因多个靶点的多个shRNA，用于RNA干扰[8-9]。同时沉默两个基因的亦有报道，如Survivin基因联合FasL基因同时干扰具有协同增强作用[10]，Survivin基因联合Livin基因同时干扰具有协同减弱作用[11]，本研究是同时针对Survivin与CDK1的shRNA联合干扰目前还未见报道，这为肿瘤治疗提供新思路。

研究发现Survivin具备以下功能：(1)影响细胞分裂：Survivin为染色体信使蛋白复合物(CPC)中的一员，与其他的染色体信使蛋白相互作用，在染色体对齐、生物定位、组蛋白H3磷酸化、纺锤体形成及运动等多种机制中起作用，Survivin蛋白缺失或功能异常都会干扰有丝分裂进程，与着丝粒/纺锤体分离异常及多倍体细胞形成相关[2，12]；(2)Survivin抑制细胞凋亡：Survivin通过提高细胞死亡门槛，与其他众多分子相互作用及影响线粒体动力学等机制产生抗细胞凋亡效应[2，12]。Survivin在多种肿瘤细胞高表达，并随着肿瘤细胞恶性程度增高而表达增加，与抗肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤组织血管增生及肿瘤细胞抵抗放疗、化疗疗效相关，与肿瘤患者的不良结局相关[3，13]。干扰Survivin基因表达的实验显示毒性作用轻微，对移植瘤模型小鼠正常的组织器官功能影响小，安全性高，为临床癌症患者进行Survivin基因表达及其功能干预治疗提供了安全保证及医学伦理学上的可行性[14-15]。CDK1可以对Survivin的34位点苏氨酸残基进行磷酸化。Rachel等[16]通过siRNA干扰技术耗竭细胞内源性Survivin，然后引入非磷酸化的Survivin(T34A)及磷酸化状态的Survivin(T34E)，证实此位点的磷酸化状态直接影响下游的凋亡程序，显示表达T34A Survivin的细胞比未引入突变Survivin的细胞增殖更快，而表达T34E Survivin的细胞增殖比未引入突变Survivin的细胞增殖慢，另对表达Survivin、Survivin (T34A)和Survivin(T34E)的Hela细胞系用不同剂量放射线照射，结果显示表达Survivin(T34E)的细胞死亡率最低，说明Survivin(T34E)具有显著的保护细胞的功能。Nathan等[17]用Flavopiridol抑制MCF-7乳腺癌细胞系Survivin 34位点的磷酸化,导致Survivin水平降低，细胞凋亡增加，此现象可能是由于T34位点磷酸化受阻影响一些潜在蛋白(如泛素)与Survivin结合，从而影响Survivin的稳定性所致。本研究采用一个pU6-M4质粒载体携带两个shRNA的干扰技术，成功构建Survivin和CDK1基因联合靶向的shRNA重组表达载体，为进一步探讨同时下调肿瘤细胞中的Survivin和CDK1基因的表达是否具有协同增强干扰效应提供了条件，也为肿瘤靶向基因治疗的可行性提供新的思路。

[1]Ambrosini G,Adida C,Altiefi DC.A novel anti-apoptosis gene,Survivin,expressed in cancer and lymphoma[J].Nat Med,1997,3(8): 917-921.

[2]Altieri DC.Survivin,cancer networks and pathway-directed drug discovery[J].Nat Rev Cancer,2008,8(1):61-70.

[3]Seiji Fukuda,Louis M,Pelus.Survivin,a cancer target with an emerging role in normal adult tissues[J].Mol Cancer Ther,2006,5 (5):1087-1097.

[4]O'Connor,DS.Regulation of apoptosis at cell division by p34cdc2 phosphorylation of Survivin.Proc[J].Natl Acad Sci,2000,13: 103-107.

[5]O'Connor DS,Wall NR,Porter ACG,et al.A p34cdc2 survival checkpoint in cancer[J].Cancer Cell,2002,2:43-54.

[6]Paddison PJ,Caudy AA,Bernstein E,et al.Short hairpin RNAs (shRNAs)induce sequence-specific silencing in mammalian cells [J].Genes Dev,2002,16(8):948-958.

[7]Bertrand JR,Pottier M,Vekris A,et al.Comparison of antisense o1igonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo[J].Biochem Biophys Res Commun,2002,296(4):l000-l004.

[8]Song J,Giang A,Lu Y,et al.Multiple shRNA expressing vector enhances efficiency of gene silencing[J].BMB Rep,2008,41: 358-362.

[9]Yan Y,Zhang J,Guo JL,et al.Multiple shRNA-mediated knockdown of TACE reduces the malignancy of HeLa cells[J].Cell Biol Int,2009,33:158-164.

[10]刘黎明,陈昌杰,陈正徐,等.可溶性FasL联合Survivin RNA干扰诱导肺腺癌细胞凋亡[J].肿瘤,2007,27(80):615-619.

[11]蔡明,王国斌,陶凯雄.Livin基因和Survivin基因联合靶向siRNA抑制大肠癌细胞增殖的作用[J].药学学报,2009,44(7):741-746.

[12]Altieri DC.Survivin,versatile modulation of cell division and apoptosis in cancer[J].Oncogene,2003,22:8581-8589.

[13]张帅,肖健云,田勇泉,等.凋亡抑制基因Survivin与鼻咽癌预后关系的研究[J].中国耳鼻咽喉颅底外科杂志,2004,10(4): 196-199.

[14]Li F,Ling X.Survivin study:an update of“What is the next wave?”[J].J Cell Physiol,2006,208(3):476-486.

[15]Altieri DC.Validating Survivin as a cancer therapeutic target[J]. Nat Rev Cancer,2003,3(1):46-54.

[16]Rachel M.A,Barrett,Toby P,et al.Phosphorylation of Survivin at threonine 34 inhibits its mitotic function and enhances its cytoprotective activity[J].Cell Cycle,2009,8:278-283.

[17]Nathan R,Wall,Daniel SO,et al.Suppression of Survivin phosphorylation on Thr34 by flavopiridol enhances tumour cell apoptosis[J]. Cancer Res,2003,63:230-235.

Constructing recombinant survivin and CDK1 tandem shRNAs pU6-M4 plasmid.

CHEN Shu-ping1,FU Sheng-miao2,ZHOU Hong-tao3,CAI Jun-hong2,LI Cheng-xue2,WANG Fu-li2,XU Mao-xuan1.1.College of Agriculture,Hainan University,Haikou 570228,Hainan,CHINA;2.Center of Medical Laboratory,People's Hospital of Hainan Province,Haikou 570311,Hainan,CHINA;3.Center of Medical Laboratory,Zhujiang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510280,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo construct recombinant survivin and CDK1 tandem shRNAs pU6-M4 plasmids.MethodsSequences of survivin and CDK1 and the restriction enzyme cutting sites of them were designed and synthesized based on the date from GeneBank.Recombinant plasmids of pU6-M4-Survivin-shRNAand pU6-M4-CDK1-shRNA were constructed and identified.Two determined plasmids were digested by restriction endonucleases then taped by T4 DNA ligase.The ligated products were transformed into competent TH5a cells,and then the recombinant clones were identified by sequencing.ResultsRestriction enzyme cleave identification and sequencing proved that recombinant survivin and CDK1 tandem shRNAs pU6-M4 plasmids were successfully constructed.ConclusionRecombinant survivin and CDK1 tandem shRNAs pU6-M4 plasmids were correctly constructed.

Survivin;Cyclin-dependent kinase 1;Short hairpin RNA;pU6-M4

R394

A

1003—6350（2014）13—1873—05

2014-02-11)

国家自然科学基金资助项目（编号：81060223）

符生苗。E-mail：smfu2000@126.com