短时受精结合早期补救ICSI技术的临床应用

韩树标，韩伟，黄国宁

（重庆市妇幼保健院，重庆 400013）

以体外受精－胚胎移植（IVF-ET）为代表的人类辅助生殖技术为广大不育不孕患者提供了生育自己孩子的可能。但是在目前的IVF中仍有约1%～10%的病例会发生受精完全失败［1］。IVF受精失败不仅仅影响辅助生殖技术的成功率，同时也给患者带来巨大的心理及经济压力。目前IVF实验室针对不明原因不育或者其他可能存在受精失败的患者，一般采取IVF和卵胞浆内单精子注射（ICSI）分半（Half-ICSI），或者短时受精结合早期补救ICSI（即授精后5～6h补救ICSI）等措施来避免完全受精失败的出现。在这些措施中应用较多的是短时受精结合早期补救ICSI方法，获得了较好的成功率，挽救了部分受精失败的周期。本文主要从短时受精对临床结局的影响、卵母细胞受精失败的判断、实施早期补救ICSI的时机等影响补救ICSI临床治疗成功率方面探讨补救ICSI技术在人类辅助生殖技术的临床应用。

一、短时受精对临床结局的影响

实施补救ICSI的前提是短时受精，即授精后早期拆除颗粒细胞观察是否受精，以便于挽救受精失败的周期。但是与常规受精相比，短时受精的受精率以及对胚胎发育的影响有待进一步验证。

首先，哺乳动物自然受精是一个严格有序的生理过程，主要包括：精卵识别、精子发生顶体反应并穿过透明带、精子与卵子质膜融合、卵子皮质反应与多精入卵的阻止以及雌雄原核的形成融合并最终启动卵裂［2］。根据这一生理过程，早期人类辅助生殖技术中一般采用精卵共培养16～18h后，然后拆除颗粒细胞观察是否受精，又称为常规受精。常规受精作为一种传统的受精方式，由于操作简便一直为大多数生殖中心采用。但Gianaroli等［3］的研究表明，长时间的精卵共孵育可能会产生高的活性氧（ROS）影响胚胎质量。同时，胚胎暴露于ROS环境中可能会导致透明带的硬化，而损伤胚胎的种植潜能［4］。Gianaroli等［5］研究表明，精卵共孵育4h与15min相比，穿过颗粒细胞层抵达卵母细胞周围的精子数量并无显著增加。这些结果表明，受精过程中长时间的精卵共孵育可能是没必要的，同时还会影响胚胎质量。

其次，相对于常规受精，短时受精更符合人体的自然受精过程。正常的人类精卵相互作用和受精发生在性交后20min内，完成精卵结合、精子穿过透明带、开始受精、皮质反应以及透明带硬化等一系列生理事件。在自然受精过程中，虽然一次性交会射出大量精子，但仅有极少数精子可以抵达卵母细胞，只有一个精子进入卵母细胞完成受精。短时受精后胚胎脱离精子移入新的培养环境中，更符合正常受精后胚胎周围的微环境。Suresh等［6］研究表明，与过夜受精相比精卵共孵育2h受精可显著提高胚胎质量、临床妊娠率以及胚胎种植率。张宁媛等［7］通过自身对照的方式研究短时受精与常规过夜受精对受精结局的影响，结果表明，3h精卵共孵育不影响受精结局。Xiong等［8］2011年的研究表明，与20h组相比，精卵共孵育6h不影响正常受精率和临床结局。2013年Zhang等［9］对近几年的文章进行系统荟萃分析，结果提示，与常规受精相比，短时受精可以提高临床妊娠率和胚胎种植率。综上，短时受精可以与常规受精一样安全有效地应用于人类辅助生殖技术。

二、受精失败判断及早期补救ICSI

受精失败的判断是实施早期补救ICSI的关键步骤，因为只有在早期对卵母细胞受精与否进行精确判断，才可以实施早期补救ICSI。在常规IVF受精过程中，受精的判断是在加精后20h左右，雌雄原核形成后，主要根据雌雄原核的个数结合第二极体情况，判断是否受精。

短时受精与否的判断标准是第二极体的排出，第二极体的判断主要受实验室胚胎技术人员的经验等的影响（图1）。

图1 短时受精后第二极体排出情况

其次，受精后的观察时机也是影响第二极体观察的最重要因素。Van den Bergh等［10］研究表明，受精后2h有56．6%的卵母细胞排出第二极体，到了3h第二极体的排出率将增加到78．3%。南京大学医学院附属鼓楼医院对常规IVF受精的正常受精周期，回顾性分析第二极体排出时间，结果发现授精后3h即有78．7%的卵母细胞排出第二极体，到了6h第二极体的排出比率可以增加到92．9%［11］。提示成熟度适当的卵母细胞如果受精，在6h应该排出第二极体。因此，早期受精判断为完全受精失败是有依据的。

一旦受精失败，患者将可能由于没有可移植胚胎而被迫取消周期，将给患者带来巨大的心理及经济压力，同时也增加了临床医生的压力。2003年Chen等［12］率先提出早期补救的理念并应用于临床治疗，将补救ICSI的时间定在加精后6h，通过对第二极体排出作为早期判断受精与否的标准，对无第二极体的卵母细胞实施补救。结果表明，补救后受精率及临床结局均有显著提高。南京大学医学院附属鼓楼医院2006～2008年的早期补救ICSI新鲜胚胎移植周期的妊娠率为57．3%［11］。显而易见早期补救ICSI技术可以作为受精失败的补救措施。

三、补救ICSI时机

目前一般是在授精后5～6h实施早期补救ICSI。Sirard等［13］的研究表明，授精5h后，大部分卵母细胞已经趋于老化，错过了受精的最佳时机，虽然此时实施补救ICSI不会影响雌雄原核的形成，但是维持胚胎正常分裂的一些细胞因子或mRNA发生了降解或修饰，从而失去了原有功能，而影响胚胎的发育速度和质量，甚至会影响胚胎的发育潜能。我们中心的数据也显示，实施补救ICSI的时机与临床结局呈负相关，即补救ICSI时机越早，其临床结局越好［14］。因此，在可能的条件下，应尽量提前对确定不受精的卵母细胞实施补救ICSI。

综上所述，对于可能存在受精失败的周期，采用短时受精不影响其卵母细胞正常受精，且可通过早期观察，判断受精是否成功。为受精失败的周期实施早期补救ICSI，可挽救部分由于受精失败而导致取消的周期。

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［14］ Liu W，Liu J，Zhang X，et al．Short co-incubation of gametes combined with early rescue ICSI：an optimal strategy for complete fertilization failure after IVF［J］．Hum Fertil（Camb），2013，available online on December 6，［Epub ahead of print］．