动态超声辅助萃取与HPLC联用测定淫羊藿中黄酮类化合物

张坤，梁秀丽

（中国兵器工业集团第五三研究所，济南 250031）

动态超声辅助萃取与HPLC联用测定淫羊藿中黄酮类化合物

张坤，梁秀丽

（中国兵器工业集团第五三研究所，济南 250031）

建立了动态超声辅助萃取与高效液相色谱在线联用系统，用于测量淫羊藿中黄酮类化合物。萃取过程在一个循环体系中完成，萃取完成后，通过采样环采集20 µL萃取液，萃取液被流动相载入色谱系统进行分离检测。4种黄酮类化合物用HPLC-MS区分，通过比较色谱峰面积选择优化萃取条件。选择50℃的水浴温度，50%的乙醇作为萃取剂，萃取剂流速为1.5 mL/min，萃取时间为8 min，样品量为15 mg。用该法测量淫羊藿样品中4种黄酮类化合物，日内、日间精密度分别为1.05%～2.05%，0.30%～3.63%（n=6）。淫羊藿中的主要化合物淫羊藿苷的加标回收率为95.2%。该方法可用于测量淫羊藿中的黄酮类化合物。

在线动态超声辅助萃取；高效液相色谱；淫羊藿；黄酮

淫羊藿（ Epimedium Kor eamum Nakai）别名仙灵脾，为小檗科淫羊藿属（family berberidaceae）植物［1］，是中国传统的益补中药，性温，味甘辛，归肝、肾经，临床上常用于阳痿遗精，筋骨酸软，风湿痹痛，麻木拘挛以及慢性气管炎、神经衰弱和心脑血管疾病等症［2-3］。现代研究表明其有效成分主要为淫羊藿苷、总黄酮及多糖。文献报道淫羊藿总黄酮、淫羊藿苷的萃取工艺有回流法［4-7］、索氏提取法［8］，这两种方法所需样品及萃取溶剂量较大，且需要较长的萃取时间。目前，一些新的方法被引用到淫羊藿的萃取中。Liu［9］等用高压密闭微波法、常压微波法、超声法、回流法萃取淫羊藿中黄酮类化合物，其中高压密闭法得到的萃取率最高，但是有些化合物在高温、高压条件下易降解。姜宁［10］等采用加速溶剂萃取系统进行淫羊藿中淫羊藿苷的快速萃取及测定，萃取时间为20 min，萃取率为93.15%。

动态萃取是最近才提出的一种崭新的方法，这种技术是基于流动的萃取溶液连续地通过固体基质将目标物质萃取出来，动态萃取最早应用于沉积物和土壤样品中重金属的萃取。近年来，动态萃取技术正逐步引起人们的重视。陈立钢［11］等采用动态微波辅助萃取的方法萃取淫羊藿中的黄酮类化合物，其产率高于索氏萃取和回流萃取。

笔者采用动态超声辅助萃取与高效液相色谱联用的方法测定淫羊藿中4种黄酮类化合物，具有分析时间短、样品用量小等优点，而且在线过滤及在线测量系统的设计减少了萃取剂的用量，降低了萃取剂对环境的危害，也降低了实验人员与萃取剂接触的可能性。该方法可用于测定淫羊藿中的淫羊藿苷及朝藿苷A，B，C的含量。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Ailgent 1100型，美国Agilent公司；

萃取池：玻璃制品，为自行设计加工，长度为60.0 mm，内径为3.0 mm；

超声波清洗器：KQ-800KDE型，功率为100 W，昆山超声仪器有限公司；

蠕动泵：FI-2100型，北京海光仪器公司；

紫外分光光度计：GBC Cintra 10e型，澳大利亚GBC科学仪器公司；

质谱仪：ABI Q-Trap型，电喷雾离子源，Analyst 1.4 数据记录系统，美国应用生物系统公司；

淫羊藿苷标准品：中国药品生物制品检验所；

淫羊藿苷标准储备液：准确称取淫羊藿苷标准品4.0 mg，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，得到0.4 mg/mL的标准储备液，然后用甲醇稀释至不同浓度，保存于冰箱中；

淫羊藿样品：市售，用粉碎机粉碎，过0.38 mm（40目）筛后备用。

1.2 实验方法

1.2.1 动态超声辅助萃取（DUAE）

自行组装动态超声辅助萃取装置。准确称取一定量的淫羊藿样品置于玻璃制成的萃取池中，样品两端用玻璃棉堵住，然后用塞子密封，将萃取池固定在超声清洗器中，量取5 mL乙醇溶液于储存瓶中，开启蠕动泵，储存瓶中的萃取液被蠕动泵泵出，流经萃取池，打开超声清洗器，萃取剂在管路中循环流动。与此同时，开启液相色谱的高压泵，建立色谱基线。萃取经过一定的循环次数后，转换六通阀，萃取剂通过在线过滤被蠕动泵泵到液相色谱20 μL的取样环中，之后转换进样阀，取样环中的萃取液被流动相载入色谱柱进行分离。

1.2.2 静态超声辅助萃取（UAE）

准确称取0.5 g淫羊藿样品于锥形瓶中，加入50 mL 50%乙醇溶液，标记刻度，将锥形瓶放在超声清洗器中超声萃取1 h，然后向锥形瓶中加50%乙醇溶液至标线，过滤萃取液，取3 mL溶液，用50%乙醇定容于10 mL容量瓶中，过0.45 μm滤膜，进样量20 μL，用HPLC分析。

1.3 仪器工作条件

1.3.1 色谱条件

1.3.2 质谱条件

气帘气和雾化气：均为N2，压力为0.21 MPa（30 psi）；喷雾电压：5 000 V；解簇电压：120 V；入口电压：10 V；碰撞能量：10 eV。

1.4 总黄酮量的测定

用紫外可见分光光度计测定淫羊藿中总黄酮的含量，检测波长为270 nm，以不同浓度的淫羊藿甘标准品溶液对应的紫外吸收峰峰面积作标准曲线，线性范围为1.24～9.92 μg/mL，线性回归方程为Y=0.055 66X-0.013 7，相关系数r=0.999 3。每次实验测定均取1 mL 萃取液，用萃取溶剂稀释至10 mL，得到适当的紫外吸光度。

2 结果与讨论

2.1 HPLC/MS分离鉴别4种黄酮类化合物

淫羊藿萃取物的色谱图如图1所示，对应的质谱数据列于表1。根据得到的质谱数据和相关文献报道［9，11］可判定，液相色谱图上的4个色谱峰对应的化合物分别是朝藿苷A、朝藿苷B、朝藿苷C、淫羊藿苷。

图1 淫羊藿萃取物的色谱图

2.2 萃取条件的优化

基于现场实际条件，山路崎岖不平，路段狭窄，不适合板状天线的推进，因此选择适应山坡路段的蛇形软质天线，即超强地面耦合天线(RTA50 MHz)执行本次勘探任务。雷达测线按垂直于坡体等高线方向单向布置，测线方向由坡脚向坡顶行进，测线覆盖整个滑坡区域，在测线的起始处沿测线方向均向外延伸5～10 m，以便进行比对分析。在滑坡后壁处，测线向后壁上方继续行进5～10 m，以便对滑坡整体机制做出合理推测和解释。本文在所有探测结果中，主要选择一条有代表性的探测剖面进行分析解译。测线布置图如上图2所示。

2.2.1 萃取剂的选择

将乙醇配成不同浓度的溶液作为萃取剂，体积分数范围为30%～70%，梯度为10%。称取10 mg淫羊藿样品，设定超声清洗器水浴温度为30℃，萃取剂流量为1.0 mL/min，萃取时间为10 min。在低浓度时，乙醇浓度与4种黄酮类化合物的萃取率成正比；乙醇浓度越高，萃取率越大；当乙醇浓度达到50%时，萃取率最大，随后萃取率下降。实验选择50%的乙醇作为萃取剂。

表1 淫羊藿萃取物中4种黄酮类化合物的质谱碎片

2.2.2 超声萃取水浴温度的影响

称取10 mg淫羊藿样品，改变水浴温度，温度范围为20～80℃，温度梯度为10℃，以50%的乙醇作为萃取剂，萃取剂流量为1.0 mL/min ，萃取时间为10 min。水浴温度对4种黄酮类化合物的萃取率影响不大，当水浴温度高于60℃时，朝藿苷C 的萃取率略有下降。实验选择50℃的水浴温度。

2.2.3 萃取剂流量的选择

称取10 mg淫羊藿样品，以50%的乙醇作为萃取剂，在超声萃取的水浴温度为50℃，萃取时间为10 min的条件下进行萃取，考察萃取剂流速对4种黄酮类化合物色谱峰面积的影响，流量范围为1.0～3.0 mL/min，梯度为0.5 mL/min，萃取剂流速对4种黄酮类化合物的产率影响不大。实验选择萃取剂流量为1.5 mL/min。

2.2.4 萃取时间的选择

称取10 mg淫羊藿样品，以50%乙醇作萃取剂，超声水浴温度为50℃，萃取剂流量为1.5 mL/min。改变萃取时间，考察萃取时间对萃取率的影响，萃取时间由1～12 min，每隔1 min试验一次。结果表明待测物的萃取率随着超声萃取时间的增大而增大，当萃取时间达6 min时，萃取率不再发生明显变化。实验选择样品萃取时间为8 min，以保证待测物的完全萃取。

2.2.5 样品量的影响

改变样品量，以50%的乙醇作为萃取剂，超声水浴温度为50℃，萃取剂流量为1.5 mL/min，萃取时间8 min，测得4种黄酮类化合物的峰面积列于表2。由表2可知，在动态超声辅助萃取中，样品量的大小对待测物萃取率的影响较小。实验选择样品量为15 mg。

表2 不同样品量4种黄酮类化合物的色谱峰面积

2.3 标准工作曲线

取不同浓度的淫羊藿苷标准品溶液，依次进样，在选定的HPLC条件下，以溶液的质量浓度c（mg/mL）为横坐标、峰面积A为纵坐标作线性回归，标准品溶液质量浓度在1.6～20 μg/mL范围内线性关系良好，线性回归方程为A=31.3c-15.19，相关系数r=0.999 1。

测定淫羊藿中总黄酮的含量，以不同浓度的淫羊藿苷标准品溶液对应的紫外吸收峰峰面积作标准曲线，线性范围为1.24～9.92 μg/mL，线性回归方程为A=0.055 66c-0.013 68，相关系数r=0.999 3。表明在线性范围内线性关系良好。

2.4 精密度和准确度

在1 d内连续分析6个淫羊藿样品，朝藿苷A、朝藿苷B、朝藿苷C、淫羊藿苷色谱峰面积测定数据见表3。由表3可知，朝藿苷A、朝藿苷B、朝藿苷C、淫羊藿苷色谱峰面积的日内精密度分别为1.05%，1.75%，2.05%，1.85%。每天分析一个样品，连续分析6 d，朝藿苷A、朝藿苷B、朝藿苷C、淫羊藿苷色谱峰面积测定数据见表4。由表4可知，朝藿苷A、朝藿苷B、朝藿苷C、淫羊藿苷日间精密度分别为0.97%，0.30%，2.78%，3.63%。

表3 日内精密度试验结果

表4 日间精密度试验结果

精密称取淫羊藿样品15 mg 3份，分别加入1.0mL质量浓度为20 μg/mL淫羊藿苷标准品储备液，室温下放置24 h后，按1.2实验方法萃取样品，淫羊藿苷回收试验结果列于表5。由表5可知，淫羊藿苷加标回收率为95.2%。

表5 淫羊藿苷加标回收试验结果

2.5 比对试验

取不同产地的淫羊藿样品（样品1、样品2、样品3的产地分别为吉林、安徽、河北），分别用动态超声辅助萃取（DUAE）法和药典方法（UAE）比较，结果见表6。由表6可知，动态超声辅助萃取法和药典方法萃取率相当，但动态超声辅助萃取法耗时短，样品和萃取剂用量少，操作简单。

表6 比对试验色谱峰面积 pA·s

2.6 淫羊藿苷和总黄酮的含量

对淫羊藿质量的评价大多以淫羊藿苷或总黄酮含量为指标，分别用动态超声辅助萃取法和药典方法对不同产地的淫羊藿样品进行萃取处理，然后测定样品中淫羊藿苷和总黄酮的含量，测定结果见表7。

由表7数据可知，不同产地的淫羊藿中淫羊藿苷的含量明显不同，总黄酮含量则相差不多。

表7 不同产地淫羊藿中淫羊藿苷和总黄酮的含量 mg/g

3 结语

用动态超声辅助萃取法萃取淫羊藿中朝霍苷A、朝霍苷B、朝霍苷C和淫羊藿苷，与药典中规定的方法得到了相似的萃取率，而本方法使用的萃取剂用量少，耗时短。该法与高效液相色谱在线联用，实现了对淫羊藿的在线萃取、分离和检测，减少了样品损失，简化了整个分析过程。

［1］叶丽卡，陈济民.淫羊藿的药理进展［J］.中国中药杂志，2001，26(5): 293-294.

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［3］孟坤，刘冠中.天然药物淫羊藿和巴戟天的免疫调节作用研究进展［J］.中国医药学报，2003，18(8): 493-495.

［4］马维坤，陈文，段国峰.淫羊藿总黄酮萃取分离工艺研究［J］.中医药学刊，2006，24(3): 157-158.

［5］张峻颖，黄罗生，陈健，等.淫羊藿醇提工艺研究［J］.海峡药学，2004，16(1): 61-63.

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［11］Chen L G，Jin H Y，Ding L，et al. Dynamic microwaveassisted extraction of flavonoids from Herba Epimedii［J］. Sep Purification Tec，2008，59: 50-57.

内蒙废止18项食品安全地方标准

4月10日，内蒙古自治区卫生计生委发布2014年第6号公告称，决定对18个食品安全地方标准予以废止，2个食品地方标准保留并进行修订。

18个废止的食品安全地方标准名称是：鲜绿芦笋，牛奶蒸馏酒，沙棘籽油中亚油酸与亚麻酸的测定（气相色谱法），内蒙古优质无公害大米，发酵性奶酒，食用沙棘籽油，食用沙棘果汁油，蒸制类面食品，非发酵豆制品，荞麦米(仁)检验规程，混糖月饼，乳及乳制品中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定（高效液相色谱法），乳及乳制品中黄曲霉毒素M1含量的测定（高效液相色谱法），脱水胡萝卜片(粒)检验规程，盐渍宝塔菜检验规程，糜、黄(大黄米)米，线麻籽油、蓖麻籽油，奶片。2个保留修订的食品地方标准名称是炒米、风干牛肉。

（仪器信息网）

Determination of Flavonoids in Epimedium Koreamum Nakai by Dynamic Ultrasonic-assisted Extraction System Coupled with HPLC

Zhang Kun， Liang Xiuli
(CNGC Institue 53， Jinan 250031， China)

The dynamic ultrasonic-assisted extraction (DUAE) system coupled with HPLC was used for determination of four flavonoids in epimedium koreamum nakai. The extraction was performed in a recirculating system. When the extraction was completed, the extract (20 µL) was driven to the analytical column by mobile phase and measured by a UV detector. The four flavonoids were identified by HPLC-MS. The extraction parameters of the procedure were optimized by comparison with the peak areas of HPLC. The extraction temperature was 50℃in water bath, the extract solvent was 50% ethanol, the extractant flow rate was 1.5 mL/min, the extraction time was 8 min, and the quantity of the sample was 15 mg. Four flavonoids were measured by the method, the RSD of intra-day and inter-day were 1.05%-2.05% and 0.30%-3.63% (n=6), respectively. The method was applied to determine icariin which was major component in the herb, and the added recovery was 95.2%. The method was successfully applied to the determination of flavonoids in epimedium koreamum nakai.

on-line dynamic ultrasonic-assisted extraction; HPLC; epimedium koreamum naka; flavonoids

O657.7

A

1008-6145(2014)03-0053-04

10.3969/j.issn.1008-6145.2014.03.015

联系人：张坤；E-mail: zhangkun8185@163.com

2014-04-10