类人胶原蛋白－微孔淀粉的制备及生物学评价

蒙俊桦，王琪凯，范代娣，段志广，乔存存，王溢萍

(西北大学 化工学院，陕西 西安 710069)

各种突发性事故中人体大出血的现象较为常见，脏器等破裂的隐蔽性渗血更是手术中的难题，医院对病人的手术过程中快速且有效的止血[1－3]是抢救生命中最关键的环节。止血材料的应用极为广泛，如外科手术、户外旅行、军事任务及各种突发性事故造成的出血创伤急救等。其中，新型止血材料的研发对由战争原因引起的出血创伤具有重要战略意义[2]。为了克服目前止血材料止血效果不确切、生物相容性差等缺陷，可快速止血的新型止血材料是现阶段该领域研究的热点。

微孔淀粉，也称多孔淀粉，因其成本低廉，被视为当今具有研究前景的止血材料。微孔淀粉属于变性淀粉的一种，它通常按照如下工艺处理:将高纯度天然淀粉不经过糊化过程直接利用酸或酶处理以后，在其表面形成孔径较为均匀的微孔，表面微孔直径约1 μm，微孔容积约占颗粒体积的50%，具有较大的比表面积，且于适当条件下分散在水等溶剂中亦能保持完整结构，具有优异的吸附性，作为药物、香料、色素等功能性物质的吸附载体或包埋剂，具有高效、安全、可降解等优点，已经被广泛应用于各行业。

新型类人胶原蛋白[4－5]为基因工程产品，分子设计思路是将人源型胶原蛋白的mRNA逆转录得到cDNA，再通过酶切和修饰后对特定序列进行多次重复，再转化于工程菌，经高密度发酵、分离、纯化等复杂过程而得到的一种水溶性高分子蛋白。类人胶原蛋白由于其优异的促细胞黏附、生长及无病毒隐患而被作为一种新型的生物材料应用于止血领域的研究[6]。

1 材料和方法

1.1 材 料

玉米淀粉(corn starch):国产分析纯，购于吉林中粮生化能源销售有限公司;十二水磷酸氢二钠:天津市化学试剂六厂 AR;柠檬酸:西安化学试剂厂AR;α-淀粉酶:上海索来宝生物科技有限公司提供，酶活5.0×104U/g;糖化酶:上海索来宝生物科技有限公司，酶活1.0×105U/g;氢氧化钠:西安富力化学厂AR;实验SD大鼠、大鼠血少量，均购自第四军医大学动物实验中心;生理盐水:实验室自配;类人胶原蛋白－微孔淀粉止血粉:本实验室自制;普通微孔淀粉:重庆泰威生物工程有限公司。

1.2 仪 器

超低温冰箱 ULT1386-3-V34，美国 REVCO;真空冷冻干燥机 FREEZONE6，美国LABCONCO;灵敏pH计METTLER TOLEDO;水浴锅;恒温加热搅拌机;TGL-16C台式离心机:上海医疗器械厂;光学显微镜:日本Olympus公司;扫描电子显微镜SEM:日立 S-750(日本);恒温水浴箱:江苏太仓市实验设备厂;分光光度计:美国MD公司;AG-245电子天平:瑞士Mettler Tolledo公司;高压蒸汽灭菌器:日本TOMY XS-500;恒温鼠兔解剖台:上海科科医学模型有限公司Cr-HTT;恒温培养箱:上海智诚分析仪器制造有限公司 ZGP-2270;超净工作台:苏州净化设备有限公司;一次性培养皿(Φ100 mm):美国康宁公司;自动移液器(吸管、带吸头):Eppendorf;玻璃器皿(250℃干热除热原);试管架或孵化反应管:西安化玻站。

1.3 实验方法

1.3.1 微孔淀粉的制备 称取一定量玉米淀粉于烧杯中，按比例加入去离子水配制成淀粉浆，再取5%的稀盐酸100 mL，加入到淀粉浆中，于50℃恒温水浴锅中保温半小时后，加入质量分数为6%的NaOH溶液中和至pH为7.0，移去上清。加去离子水溶解，以3 000 r/min离心10 min，再移去上清。重复操作3次，直至pH基本稳定。

取100 g经酸处理后的玉米淀粉于烧杯中，按比例加入去离子水，调配成40%质量浓度的淀粉浆，搅拌均匀，放入恒温水浴锅中保温30 min。

称取一定量的糖化酶、α-淀粉酶[7～9](酶配比按照糖化酶100 U/mg，α-淀粉酶50 U/mg为准)。再制备缓冲溶液，称取1.42 g Na2HPO4溶于50 mL容量瓶中，准确定容，得到0.2 mol/L的溶液;精确称量1.47 g柠檬酸于50 mL容量瓶中，定容得到0.1 mol/L的溶液。先加Na2HPO4，再加柠檬酸，调整pH。最后加入酶的混合物配制成混合溶液，再次调整pH。

混合淀粉浆与酶体系，放于50℃的恒温搅拌机上加热搅拌反应数小时。反应结束后，向混合体系中加入6%的NaOH，调整pH至7.0。转入离心管中进行离心洗涤处理，并维持pH为7.0左右，重复试验5次。

将洗涤结束的淀粉[5]于恒温烘干箱中进行干燥，在55℃下进行烘干48 h后，除去上层糖化酶固体，加入去离子水混合均匀，倒入培养皿中，冻干粉碎。

1.3.2 类人胶原蛋白－微孔淀粉复合材料的制备[2]取出一定量实验室自制微孔淀粉，在离心管中加去离子水溶解成浓溶液，加入一定量的类人胶原蛋白摇匀[10－11]。在5 000 r/min下离心10 min，取出倒弃上清，平行实验3次。用0.2%(V/V)戊二醛乙醇溶液交联微孔淀粉与类人胶原蛋白混合物，交联温度为50℃，时间为20 h，结束后要洗涤、离心再冻干。将充分混合的溶液倒至一次性培养皿中，按每分钟下降0.1℃的速度对蛋白溶液进行程序冷冻;程序冷冻结束后迅速转移至已经预冷好的冻干机内进行真空冷冻干燥，冷阱温度约－50℃，干燥36 h后取出。

1.3.3 复合酶解法正交实验分析[12－13]根据复合酶解单因素实验结果设计了L9因素水平如表1所示。

表1 复合酶解正交实验L9(43)因素水平表Tab.1 Composite enzyme solution orthogonal experiments L9(43)factors level table

1.3.4 扫描电镜(SEM)分析 将淀粉样品粉碎后，均匀地撒在贴有导电胶的样品样品台上，用扫描电镜观察，观测微孔淀粉的表面形态，由SEM图片分析软件得到淀粉的微观图。

1.3.5 吸水率的分析 以吸水率考量微孔淀粉的吸附性，吸附性直接影响了微孔淀粉止血效果。精确称量一定量的样品，记作M1，室温下用去离子水搅拌20 min后用真空抽滤机抽滤直至没有水滴下，精确称量吸附了水的淀粉的质量，记作M2。按以下公式计算吸水率:

吸水率 =[(M2－M1)/M1]×100%

称取一定量的类人胶原蛋白－微孔淀粉止血材料，分别加入20℃蒸馏水中，轻微搅拌，约30 min充分吸水后，分别用真空抽滤机抽滤，将水分排净，称重，精确至0.001 g，计算各组样品吸收水分的质量与样品质量的比值，求平均值后再乘以100%即为吸水率。

1.3.6 实验大鼠肝脏止血实验[14－16]将实验用SD大鼠分为类人胶原蛋白－微孔淀粉组和普通微孔淀粉组，每组5只健康实验大鼠，均常规饲养，腹腔注射2.0%戊巴比妥钠溶液对试验大鼠进行麻醉后固定于恒温台上，所用手术器械均湿热灭菌烘干，手术过程严格按照外科手术要求进行操作，备皮处用碘伏消毒后75%酒精脱碘，逐层开腹，待可见肝脏时用海绵钳垫无菌纱布将肝脏缓慢拉出，用手术刀在肝叶划大约l.0 cm×1.0 cm的切口，分别将准备好的类人胶原蛋白—微孔淀粉止血材料、普通微孔淀粉止血材料撒上切口并使用无菌纱布敷压切口，记录止血时间，观察两种微孔淀粉在创面的粘附情况并对手术部位拍照保存。

2 结果与讨论

2.1 复合酶解法正交实验结果

表2给出了复合酶解制得的微孔淀粉的吸水率正交实验结果和极差分析。

表2 复合酶解正交实验结果和极差分析Tab.2 Composite enzyme solution orthogonal experimental results and range analysis

由表2可知，4个因素对微孔淀粉吸水率的影响依次为:B＞A＞D＞C，即酶解时间＞酶加入量＞pH值＞反应温度。而根据极差分析可以得到复合酶的最佳参数为:A2B2C1D1，即酶使用量为理论水解掉40%淀粉的量，酶解时间20小时，酶解温度50℃，pH为4.8。

2.2 扫描电镜结果与分析

由图1分析可得，经处理过后，淀粉表面分布有较多的微孔。从微观角度上，微孔淀粉堆积密度和颗粒密度低，结构疏松且具有较大的比孔容和比表面积。这使微孔淀粉具备良好的吸附性，表现出分子筛的作用。

图1 微孔淀粉扫描电镜(SEM)Fig.1 SEM of Microporous starch

2.3 类人胶原蛋白－微孔淀粉止血材料的吸水率测定结果

经计算，试验中类人胶原蛋白－微孔淀粉的吸水率如表3所示。

表3 类人胶原蛋白－微孔淀粉止血材料吸水率的测定Tab.3 Human-like collagen-microporous starch hemostatic materials bibulous rate measurement

计算后求得类人胶原蛋白－微孔淀粉的平均吸水率为3 580%。

本工艺制备的微孔淀粉具有良好的吸水率，为获得较出色的止血效果奠定了物理基础。能否吸收创面的最初渗血在创面止血中极为关键，若不能及时吸收最初渗血，很可能対术区造成大面积污染或必须使用其他止血手段进行二次辅助止血，增大手术难度，所以良好的吸水率反映了材料的预期止血效果，是止血材料性能优劣的重要参考指标，关注该指标是我们在今后制备工艺优化过程的一个重点。

2.4 大白鼠肝脏止血实验结果

由表4可得，相较于外购来的止血剂，复合材料的止血时间更短而且误差更小。说明用戊二醛复合类人胶原蛋白与微孔淀粉所制成的产品兼具有两者的优势。

表4 二种止血粉对大鼠创面的止血时间Tab.4 Two kinds of styptic powder to stop bleeding time in rats liver

3 结论

1)通过电镜观察发现，经酸解、酶解反应处理后，淀粉颗粒成孔明显，表面孔隙分布密集均匀，经材料吸水率测定显示材料吸水率有明显提高，符合制备止血材料所必须达到的条件基础。

2)通过正交试验优化后的工艺条件为:α-淀粉酶:糖化酶=1∶3，反应温度为50℃，反应时间为20小时，pH值为4.8。

3)在实验大鼠体外肝脏实验结果显示，类人胶原蛋白－微孔淀粉止血剂相对于微孔淀粉可以更高效地吸收出血点所渗出的血液，并与材料形成复合物而达到止血效果。

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