IL-18对分泌性中耳炎模型大鼠中耳IFN-γ和IL-4表达的影响

刘华 赵守琴 高占梅 范尔钟 李洁 宋扬

目前研究认为中耳黏膜同其他呼吸道黏膜功能相似，反应方式相同，同样可以发生变态反应[1,2]。变态反应是导致具有变应性体质的分泌性中耳炎(otitis media with effusion,OME)患者中耳渗液持续不愈的主要原因之一。抗原刺激下中耳局部微环境中T细胞激活，T辅助细胞(T helper cell,Th)分化发生偏移，导致Th1 /Th2失衡，产生以Th2 细胞过度增殖、活化和细胞因子过量分泌的Th2反应，被认为是OME患者中耳变应性炎症的重要特征[3,4]。免疫学研究发现Th1和Th2细胞在不同水平可以相互调节[5]，一方面，Th2细胞因子-白细胞介素4(interleukin 4，IL-4)诱导Th0细胞不断分化为Th2细胞，进一步大量分泌IL-4，从而维系Th2极化反应；另一方面，Th1细胞因子-干扰素γ(interferon γ, IFN-γ)可以发挥截然相反的作用，导致Th1 /Th2平衡转向Th1偏移， 因此，通过调节Th1 /Th2失衡状态成为免疫治疗研究的热点。白细胞介素18(IL-18)是新近发现的一种免疫调节因子，最初因为能强力诱导IFN-γ的产生，而被定义为IFN-γ诱导因子，进一步研究发现其还能通过促进T细胞的增殖、增加自然杀伤(natural killer,NK)细胞的毒性等方式发挥多种免疫调节作用[6]。IL-18在哮喘和变应性鼻炎中的作用受到关注，但其在中耳变应性炎症时发挥何种调节作用有待探讨，本研究拟通过观察OME模型大鼠在应用IL-18后中耳微环境中炎症细胞的增殖情况以及IFN-γ和IL-4的表达变化，探讨IL-18对OME大鼠中耳炎症的调节作用。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组 雄性SD大鼠18只(36耳)(SPF级，北京维通利华实验动物技术有限公司)，体重250～300 g。随机分为对照组(A组)、OME模型组(B组)和IL-18注射组(C组)，每组各6只(12耳)，全部动物经耳内镜检查证实无外耳道及中耳感染。

1.2实验试剂 卵清蛋白干粉( Ovalbumin , OVA) V级，购自美国Sigma公司；兔抗大鼠IFN-γ抗体及兔抗大鼠IL-4抗体，均购自武汉博士德生物工程有限公司；DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；重组大鼠IL-18，购自美国R&D公司。

1.3分泌性中耳炎模型建立 造模方法参考Hardy的方法[7]，采用1.2 mg OVA溶于0.6 ml磷酸缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)，再以5.14 mg氢氧化铝(购自北京化学试剂公司)溶于0.6 ml PBS作为免疫佐剂对B组和C组大鼠行腹腔注射，第8天重复注射一次, 此为全身致敏阶段；第15天用10 %水合氯醛15 mg/kg对该2组大鼠行腹腔注射麻醉，在手术显微镜下经鼓膜以微量进样器将0.1 mg OVA溶于35 μl PBS后注入大鼠中耳腔，第16天再次麻醉，耳内镜观察鼓膜情况，并重复第2次注射, 此为耳内激发阶段，制成OME模型。耳镜检查发现鼓膜明显内陷、红斑，部分可见液平面及中耳内气泡形成，视为造模成功。

A组大鼠在全身致敏阶段以5.14 mg氢氧化铝溶于1.2 ml PBS腹腔注射, “耳内激发阶段”用PBS替代OVA；C组在OME造模同时于第1、2、7、8、15、16天时分别腹腔注射重组大鼠IL-18 1 μg加生理盐水0.2 ml(IL-18应用剂量及方法参考张惠兰等[8]的研究)，A、B两组在相同时间点腹腔注射生理盐水0.2 ml。

1.4观察鼓膜及中耳灌洗液中细胞因子含量检测 实验第18 天时各组大鼠麻醉后显微镜下观察鼓膜，然后断头处死, 取出双侧听泡, 自听泡钻孔，以50 μl PBS灌洗中耳腔3次并收集灌洗液150 μl，4 ℃ 4 000×g离心10 min后，取上清液冻存于-80 ℃待测细胞因子。以ELISA试剂盒(购自晶美生物工程有限公司)检测中耳渗液中IFN-γ、IL-4浓度。

1.5细胞计数方法 取各组大鼠双侧中耳组织标本，用4 %的多聚甲醛固定, 10%EDTA溶液脱钙,经脱水后,石蜡包埋切片，常规HE染色，光镜下观察中耳的病理变化,计数嗜酸性粒细胞,甲苯胺蓝染色计数肥大细胞。自中耳鼓室段起始处切片, 厚度为3～ 4 nm, 出现管腔状结构后, 连续切片选取第9、10 张。低倍镜下于中耳黏膜上皮下固有层及骨髓腔选取5 个细胞数多的视野( 黏膜1 个视野, 骨髓腔4 个视野) , 高倍镜下计数细胞。

1.6统计学方法 采用SPSS11.5统计软件包，各组间比较用方差分析F检验，两组间差异比较用q检验(LSD法)，均以P<0.05(双侧检验)为差异有统计学意义。

2 结果

C组麻醉意外死亡1只，余各组无动物死亡。

2.1各组动物鼓膜像表现 A组鼓膜基本正常，可见少量放射状血管纹，B组鼓膜及周围组织出现充血，鼓膜有放射状扩张的血管纹，可见明显内陷、红斑，部分动物可见液平面及中耳内气泡形成。C组出现鼓膜内陷、充血和放射状血管纹，少数动物可见气泡(图1)。

图1 三组动物鼓膜图像 (a、b、c分别为A、B、C组)图2 三组大鼠中耳黏膜厚度比较 (a、b、c分别为A、B、C组)(HE 40×10)图3 三组动物黏膜纤毛上皮观察情况 (a、b、c分别为A、B、C组)(HE 40×10)图4 三组动物中耳细胞计数 (a、b、c分别为A、B、C组)

2.2各组动物中耳粘膜病理改变 光镜观察：A组纤毛上皮轻度肿胀，纤毛结构正常，排列整齐。B组咽鼓管鼓室段纤毛上皮肿胀，纤毛排列紊乱，部分纤毛脱落，中耳黏膜明显增厚，毛细血管扩张，中耳黏膜下层、骨髓腔中有较多嗜酸粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞，此外咽鼓管周围组织中肥大细胞增多、脱颗粒。C组中耳黏膜和咽鼓管鼓室段黏膜炎症较B组无明显减轻(图2，3)，中耳黏膜或骨髓腔中性粒细胞较B组明显增多(P<0.05)，嗜酸粒细胞计数仍多于对照组(P<0.05)(表1)。

表1 三组动物中耳黏膜下固有层或骨髓腔中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、咽鼓管周围组织肥大细胞计数(个，

注：*与B、C两组比较，P<0.05；△与B组比较，P<0.05；#与C组比较，P<0.05

2.3IL-18对中耳微环境中Th1、Th2细胞因子的影响 由表2可见，三组动物中耳IFN-γ含量比较差异有统计学意义，C组IFN-γ浓度明显高于B组和A组(P<0.05)，B组IFN-γ含量稍高于A组，但差异无统计学意义(P>0.05)。三组IL-4含量比较差异有统计学意义，B组和C组中耳灌洗液IL-4含量明显多于A组(P<0.05)，而C组IL-4浓度稍高于B组，但差异无统计学意义(P>0.05)。三组Th1 /Th2(IFN-γ/IL-4)比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组中耳灌洗液中IFN-γ和IL-4含量及IFN-γ/IL-4比值

注：*与其他两组比较，P<0.05

3 讨论

既往研究发现，在抗原刺激下，中耳局部微环境中的炎症基因过度或异常表达，嗜酸性粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞等多种免疫细胞激活分泌细胞因子及转录因子参与OME的发病[9]，Th1 /Th2免疫失衡与OME中耳变应性炎症的发病关系密切[10]。Th1和Th2细胞在不同水平可以相互调节，通过下调过度的Th2病理反应调节Th1 /Th2失衡状态有可能成为治疗变应性炎症的重要手段。Pollock等[11]通过动物实验研究发现应用可溶性IL-4受体和IL-5抗体拮抗Th2反应中的重要效应因子的作用，可明显改善变态反应导致的咽鼓管功能障碍，并减轻中耳和咽鼓管炎症反应。孙荣等[12]发现卡介苗注射后能扭转OME动物模型中Ⅰ型变态反应的发生发展，其机制可能为卡介苗增强Th1型反应进而抑制过度的Th2反应，调节了Th1 /Th2失衡状态。

IL-18是IFN-γ 产生的主要诱导因子之一， 主要由T细胞、NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞分泌的一种多功能细胞因子，既能促进先天性免疫又能促进Th1 /Th2免疫反应的调控[5]。研究发现IL-18 可单独或者通过与IL-12 协同作用于Th1 细胞[13],通过诱导IFN-γ的产生，上调Th1型免疫应答, 进而抑制Th2细胞的增殖，减少Th2炎性介质(尤其是IL-4、IL-5)的释放，进一步抑制IgE的产生和嗜酸性粒细胞的聚集，逆转变应性炎症的Th1 /Th2免疫偏极化，从而在气道变应性反应的发生发展中发挥重要的保护作用[13，14]。本研究发现，在大鼠OME模型抗原致敏和激发阶段应用IL-18注射后，IL-18注射组大鼠中耳灌洗液中IFN-γ含量明显高于OME组和正常对照组，说明IL-18作为IFN-γ诱导因子，可通过刺激OME大鼠中耳灌洗液中中性粒细胞、T细胞等效应细胞，大量合成IFN-γ，显著上调Th1反应，与其在呼吸道中的作用相似[14，15]。但是，IL-18注射组中耳IL-4蛋白含量并未显著下调，反而稍高于OME组，且IL-18注射组和OME组中耳IL-4浓度均明显高于正常对照组；光镜观察发现IL-18注射组大鼠中耳黏膜下层可见中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞等炎性细胞募集，中耳黏膜下层及骨髓腔中中性粒细胞数量较OME组显著增多，嗜酸粒细胞虽较OME组有所减少但仍明显多于正常对照组。上述结果与张惠兰[7]、陈湘琦等[15]的研究发现IL-18可抑制哮喘小鼠气道中的浆细胞和嗜酸性粒细胞浸润，改善过度Th2反应，在气道炎症中发挥保护作用有所不同。

Nakanishi等[16]提出, IL-18对Th1 /Th2免疫反应具有双重作用：一方面通过IFN-γ依赖途径强化Th1反应；另一方面，在一定条件下IL-18 具有激活NF-κB途径启动Th2细胞分化及分泌Th2 细胞因子( IL-4、IL-13 和GM-CSF等) 的潜能，还能通过非IL-4 依赖途径上调特异性IgE 生成[17]。同时IL-18上调NK细胞毒性和影响FasL/Fas介导的细胞凋亡过程[18]，从而加重气道上皮细胞和组织的损伤，与哮喘和变应性鼻炎等呼吸道变应性炎症的持续存在有关[19～21]。本研究结果也表明IL-18作为一种具有多重效应的生物因子，可刺激OME大鼠中耳微环境中IFN-γ大量合成，显著上调Th1反应；同时，持续维系以IL-4过量分泌为特征的Th2极化反应，从而发挥对Th1 /Th2免疫反应双重调节作用，参与OME大鼠中耳变应性炎症过程。此外，推测通过影响程序化的细胞凋亡过程，维持以Th细胞为主的多种免疫细胞过度活化，多种促炎因子过度分泌的免疫紊乱状态，最终导致OME大鼠中耳粘膜上皮系统持续损伤，是IL-18在OME病理反应中的另一种潜在机制。因此，深入分析IL-18与OME的关系，不断发现IL-18在OME免疫反应中独特的调节作用及内在机制，将会为OME的诊断和治疗提供新的靶点。

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