抗磷脂抗体促进ox-LDL诱导U937细胞泡沫化进程及对VEGF分泌的影响

白 玲，刘 平，马爱群，杜 媛，霍建华，范力宏，强 华

(西安交通大学医学院第一附属医院心血管内科，环境与疾病相关基因教育部 重点实验室，陕西省分子心脏病学重点实验室，陕西西安 710061)

抗磷脂抗体(antiphospholipid antibody, APA)的出现伴随着临床高发的心肌梗死和脑血栓形成。有研究表明APA是动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)的独立危险因子[1-2]。近年来的研究主要集中在APA对血管内皮细胞功能、凝血异常方面。目前为止，APA的生理功能以及在AS形成中的确切机制尚不清楚。动脉壁富含脂质的泡沫细胞是AS的重要特征，氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)在细胞内集聚是泡沫细胞得以形成的原因，被自身抗体—抗ox-LDL抗体包被的ox-LDL更易于被单核巨噬细胞吞噬。已有研究[3]显示ox-LDL与APA有交叉反应，但尚未见APA对单核巨噬细胞摄取ox-LDL及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)分泌的影响的报道。VEGF是一个高度特异的血管内皮促分裂因子，可促进斑块内血管新生，从而与AS斑块生长、破裂、出血、血栓形成密切相关[4-5]。本研究目的在于探讨ox-LDL诱导人髓系单核细胞株U937泡沫化过程中，APA对细胞泡沫化进程和分泌VEGF蛋白的影响,从而探讨APA致AS的机制。

1 材料与方法

1.1材料人髓系白血病单核细胞U937购自中国科学院上海细胞生物所。胎牛血清、RPMI 1640购自Gibco，胆固醇测定酶为Sigma公司产品, VEGF的ELISA试剂盒购于R&D Systems公司，其余试剂为国产分析纯。

1.2APA的亲和纯化、定性及蛋白定量选取6例APA阳性冠心病患者，各留取10 mL枸橼酸抗凝血，用Harris方法制备APA亲和纯化液。对提纯APA用考马斯亮蓝G-250进行定量及ELISA进行定性检测。APA制备液用考马斯亮蓝G-250定量测定蛋白浓度为0.35 mg/mL，ELISA定性实验表现出对心磷脂高度结合活性，抗体滴度>1∶100。

1.3LDL的制备、氧化修饰与鉴定常规分离新鲜健康人空腹血清，序列超速离心分离LDL(d=1.019～1.063 g/mL)，经琼脂糖电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳均显示单一蛋白带，Lowrry法测蛋白浓度。将LDL置于10 μmol/L CuSO4的PBS溶液(pH 7.2)中，37 ℃透析24 h，换200 μmol/L EDTA的PBS终止反应，过滤除菌后4 ℃保存。LDL氧化程度用硫代巴比妥酸反应值(TBARS)反映，新鲜的LDL TBARS为1.5 μmol/g，CuSO4处理的LDL的TBARS为22.3 μmol/g，经证明LDL已被氧化。

1.4实验分组U937为悬浮细胞，用100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养基在37 ℃、50 mL/L CO2条件下培养，细胞密度为109个/L，每2 d换液1次，为达实验目的分为3组：正常对照组、ox-LDL处理组(ox-LDL为80 mg/L)、ox-LDL与APA处理组(ox-LDL为80 mg/L、APA为100 mg/L)，均于处理48 h后收集细胞。

1.5电镜下细胞形态的变化将实验获取的细胞用戊二醛固定，1 000 r/min离心10 min，去上清制备细胞团块，送西安交通大学医学院电镜室，透射电镜下观察胞浆内脂质空泡及细胞染色质的变化。

1.6细胞内胆固醇及胆固醇酯的测定收集的细胞用PBS清洗3次，0.7 mL的已烷∶异丙醇(V/V=3∶2)抽提细胞脂质2次，N2气流下吹干，细胞内游离胆固醇和总胆固醇含量测定参照修饰的酶荧光法进行，测定荧光强度的激发波长为320 nm，发射波长为407 nm，胆固醇酯为总胆固醇与游离胆固醇之差。

1.7细胞群染色体DNA片段(DNALadder)的观察用酚-氯仿-异丙醇抽提细胞总DNA，15 g/L琼制糖凝胶电泳，溴化乙啶染色，紫外灯下观察DNA片段。

1.8ELISA检测VEGF蛋白分泌采用ELISA双抗夹心法，收集培养细胞上清液，按说明书步骤操作，492 nm处测定细胞上清液中VEGF蛋白浓度。

2 结 果

2.1细胞内胆固醇和胆固醇酯含量的比较正常对照组、ox-LDL处理组、ox-LDL与APA处理组细胞内胆固醇和胆固醇酯的含量见表1。结果显示，ox-LDL促使细胞内脂质含量增加，但胆固醇酯与总胆固醇之比小于50%，细胞整体生化指标尚未达到泡沫化的程度；而APA存在下细胞摄取ox-LDL增加，该组细胞内胆固醇酯与总胆固醇之比大于50%，达到泡沫细胞的程度。

2.2U937细胞的形态学改变透射电镜下，正常对照组U937细胞内无脂质空泡(图1A)。而ox-LDL处理组细胞体积增大，细胞胞质内出现大量空泡(图1B)，但染色质无明显变化。Ox-LDL与APA共同处理组，细胞体积变小，胞质内脂质空泡进一步增加，有些脂质融合成空泡，细胞转变为泡沫细胞。细胞染色后脂质浓缩、靠边、呈新月形改变，部分细胞核裂解，出现调亡小体(图1C)，说明APA不仅促使细胞内ox-LDL堆积，而且导致细胞出现凋亡现象,加速ox-LDL诱导下U937细胞的泡沫化进程。

表13组细胞内胆固醇和胆固醇酯含量的比较

组 别例数胆固醇(mg/g)胆固醇酯(mg/g)总胆固醇(mg/g)胆固醇酯/总胆固醇(%)正常对照组6215±1087±10302±1328.81ox-LDL组6243±7226±12469±1348.18*ox-LDL+APA组6276±10384±13660±1458.18*△

与正常对照组相比，*P<0.05；与ox-LDL组相比，△P<0.05；APA：抗磷脂抗体。

图13组细胞电镜下的形态学变化

Fig.1 Morphological changes of three group cells under electron microscope (×5 000)

A：正常U937细胞表面光滑，胞质内无脂质颗粒；B：电镜下80 mg/L ox-LDL作用后的U937细胞，形态多边形，形似巨噬细胞，胞质内可见到脂质空泡；C：电镜下80 mg/L ox-LDL+APA作用后的U937细胞，部分细胞核固缩、靠边，形成新月形改变，可见典型凋亡小体，同时细胞呈现泡沫化；APA：抗磷脂抗体。

2.3经APA处理后的细胞出现凋亡现象APA处理组的细胞提取DNA，经18 g/L琼制糖凝胶电泳后出现阶梯状(Ladder)条带，进一步证明电镜观察到的APA作用后的细胞样品有凋亡细胞存在(图2)。

图2C组DNA“梯形条带”的琼脂糖电泳图

Fig.2 Agarose gel electrophoresis of DNA“ladder” in Group C

M2：λ-Hind ⅢDNA marker；C组：APA处理组；M1：100 bp DNA Ladder；APA：抗磷脂抗体。

2.4细胞分泌VEGF蛋白含量的比较U937细胞在ox-LDL单独作用下，细胞分泌VEGF较正常细胞明显增加；APA与ox-LDL共同作用下，VEGF的分泌进一步增加(表2)。

表23组细胞分泌VEGF蛋白含量的比较

Tab.2 Comparison of the levels of VEGF protein secreted in U937 cells in the three groups

组 别例数VEGF蛋白的含量(pg/mL)正常对照组61515±134ox-LDL组62334±178*ox-LDL+APA组62716±145*△

与正常对照组相比，*P<0.05；与ox-LDL组相比，△P<0.05；APA：抗磷脂抗体。

3 讨 论

抗磷脂抗体像同型半胱氨酸一样也是近年来被人们意识到的新型致AS因子，它的出现伴随着临床高发的缺血性心脑血管事件[6-7]。我们既往的研究也表明冠心病患者血清APA的阳性率明显高于正常健康人群[8]。APA通过与带负电荷磷脂的靶物质结合而发挥其致病作用，由于作用的靶抗原广泛存在于体内，目前APA致AS的机制并不清楚。大多学者认为APA与内皮细胞膜上磷脂结合后使内皮细胞释放PGI2、NO、细胞粘附分子、IL-1改变及抗血栓能力减弱是APA致AS的重要机制。

巨噬细胞通过清道夫受体无反馈性的大量摄取ox-LDL后衍变成富含胆固醇酯的泡沫细胞是AS的标志，而被自身抗体—抗ox-LDL包被的ox-LDL更易于被巨噬细胞吞噬。有研究显示APA与ox-LDL有交叉反应，APA不能与LDL结合，却能与ox-LDL反应，可能系LDL被氧化修饰时暴露出APA作用的靶物质[9]，但APA对ox-LDL的致泡沫细胞的形成作用并不清楚。本研究结果表明U937细胞受ox-LDL作用后细胞由圆形转变为巨噬细胞特有的多角形，表明细胞由单核细胞分化为巨噬细胞，而且生化及形态学也显示胞浆内有大量脂质沉积，证明ox-LDL是细胞内脂质的主要来源。虽然整体生化水平上细胞尚未达泡沫化程度，可能与ox-LDL作用的剂量及时间有关。而在有APA共同存在条件下，透射电镜可见大量脂滴融合形成脂质空泡，胞浆内胆固醇酯的含量也超过总胆固醇的50%，APA处理后的细胞无论在形态上还是生化指标均符合泡沫细胞的定义，说明APA有明显的促ox-LDL诱导下U937细胞泡沫化进程。

此外，当APA与ox-LDL共同存在时，透射电镜下观察到U037细胞染色质固缩、靠边、形成新月体，甚至出现凋亡小体；凝胶电泳DNA也出现“梯状谱带”，说明APA在促使ox-LDL被摄取的同时也加速了细胞的凋亡。AS斑块中有大量的凋亡细胞，主要来源于吞噬脂质的巨噬细胞及平滑肌细胞[10]。在早期，血管壁主要是巨噬细胞吞噬ox-LDL以消除对血管的损害。随危险因素持续存在，脂质大量堆积的同时细胞出现凋亡，而凋亡使细胞崩解脂质沉积于血管壁，加速AS的进展[11]，也是斑块不稳定因素。本研究发现APA有促ox-LDL致巨噬细胞凋亡的作用，说明APA有加速血管壁脂质沉积作用，从而加速AS形成。

VEGF是一个高度特异的强血管内皮促分裂因子和血管生成因子[12-13]。VEGF作用于内皮细胞，促进内皮细胞增殖、生理性和病理性血管增生及血管通透性增加。已有研究表明体内斑块中VEGF表达增加，诱使AS斑块内血管生成，同时使粘附分子等炎症因子产生。促进炎症细胞对血管壁的粘附，从而加速AS的进展及斑块的不稳定性[14-15]。本研究发现ox-LDL诱导单核-巨噬细胞泡沫化进程中，VEGF分泌增加，当APA存在时，不仅细胞脂质沉积明显，凋亡细胞出现，同时细胞分泌VEGF增加也较ox-LDL单独存在时更为明显。说明APA从多个环节参与AS的发生和发展过程。

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