缺氧诱导的肿瘤特异性基因治疗载体的靶向性鉴定

贺 赛，郑见宝，孙学军，陈南征，周培华，贾蓬勃， 魏光兵，王 晖，姚建锋，禄韶英

(西安交通大学医学院第一附属医院普通外科，陕西西安 710061)

设计具有靶向性和安全性的基因转运系统，寻找肿瘤特异性转录调控元件，从而使外源基因能够持续、稳定和特异表达是目前肿瘤基因治疗的主要研究方向之一[1-3]。肿瘤特异性hTERT启动子能在转录水平上驱动下游基因的表达，高效、选择性地在肿瘤组织中激活其后的外源基因的转录，从而实现治疗基因在肿瘤中的选择性表达，避免损伤周围正常组织[4-5]。为了进一步提高该启动子在肿瘤组织中的表达特异性并增强其活性，根据实体瘤组织局部的缺氧微环境特点以及缺氧反应元件(HRE)可使异源启动子在缺氧微环境下激活的特性[6-8]，本课题组前期构建完成了5个拷贝的HRE和hTERTp双靶向联合调控元件，调控抑癌基因CDX2表达的慢病毒表达载体(5HhC)，并完成病毒包装及滴度测定。本研究利用5HhC病毒感染hTERT+LoVo细胞及hTERT-HK-2细胞,并在缺氧和常氧环境下检测5HhC/LoVo细胞中CDX2的表达，研究缺氧环境对治疗载体5HhC表达的调控作用，为利用缺氧微环境强化肿瘤的靶向性基因治疗提供实验依据，并为下一步的细胞实验奠定了基础。

1 材料与方法

1.1材料实验组细胞hTERT+人结肠癌细胞株LoVo、对照组细胞hTERT-人肾小管上皮细胞株HK-2以及慢病毒表达载体5HhC病毒液均由本课题组前期保存。胎牛血清和DMEM培养基购自GIBCO公司。逆转录试剂盒及PCR所用试剂和酶均购自TaKaRa公司。DNA marker系广州东盛科技有限公司产品。二氯化钴(CoCl2，相对分子质量237 930)、琼脂糖和四唑氮蓝(MTT)购自Sigma公司，哺乳动物细胞蛋白裂解液(RIPA)及BCA蛋白定量试剂盒均购自北京中杉生物科技有限公司。CDX2 多克隆抗体购自Epitomics公司，RNA提取试剂盒是Promega公司产品。

1.2MTT法检测CoCl2对结肠癌细胞株LoVo生长增殖的影响取对数生长期的LoVo细胞以2 000个/孔接种4块96孔板，培养过夜。每块96孔板均加入不同浓度(100、200、300、400、500 μmol/L)的CoCl2溶液，各浓度设置5个副孔，作用1、3、5、7 d后分别终止反应，每孔加入50 μL MTT溶液(5 mg/mL)，继续培养4 h；小心吸弃上清液，每孔内加入150 μL二甲亚砜(DMSO)，振荡15 min溶解沉淀，酶标仪在490 nm下读取吸光度A值。上述实验重复3次，绘制细胞在不同浓度CoCl2作用下的生长曲线，不加CoCl2的肿瘤细胞作为空白对照。

1.3免疫细胞化学法检测慢病毒载体5HhC表达将清洁、灭菌处理的盖玻片铺于24孔板底部，将处于对数期生长的hTERT+LoVo细胞及hTERT-HK-2细胞(3×104/mL)接种于板内，待细胞长成单层后，根据之前本课题组检测的病毒滴度(1×108TU/mL)及感染效率，用5HhC慢病毒液5 μL/孔感染LoVo与HK-2细胞，继续培养48 h。取出盖玻片，用0.01 mol/L PBS冲洗2遍，再以40 g/L多聚甲醛固定30 min，TritonX-100固定20 min，使用FLAG兔抗人一抗(1∶100，Sigma)4 ℃孵育过夜，加入1∶500生物素化羊抗兔二抗37 ℃孵育30 min，然后滴加SABC试剂37 ℃孵育20 min，最后用DAB显色，光镜下观察。

1.4Westernblot检测缺氧微环境调控下细胞内CDX2蛋白的表达水平复苏前期筛选的稳定表达5HhC的LoVo细胞(5HhC/LoVo)，传代后随机分为缺氧组和常氧组，缺氧组用不同浓度(100、200、300、400、500 μmol/L)的CoCl2溶液模拟缺氧环境培养24 h，常氧组及正常LoVo细胞在普通培养基中培养24 h。用上述实验获得的CoCl2有效浓度作用5HhC/LoVo细胞12、24、36 h，常氧组作为对照。RIPA裂解法提取上述细胞总蛋白，BCA法测蛋白浓度，与5×SDS凝胶加样缓冲液混合，100 ℃ 5 min变性蛋白，100 g/L十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转PVDF膜20V，40 min，以含50 g/L脱脂奶粉的TBS-T室温封闭1 h，加CDX2一抗(1∶2 000)，β-actin一抗(1∶2 000)，4 ℃过夜；二抗(1∶3 000)室温1 h，ECL显影，凝胶成像系统扫描。各组实验重复3次。

1.5RT-PCR检测缺氧微环境调控下细胞内CDX2mRNA的表达水平实验分组同1.4，缺氧组加入CoCl2溶液(使用浓度依据步骤1.4结果)培养24 h。用Trizol按说明书要求提取细胞RNA，并逆转录为cDNA。以β-actin为内参照，根据Genbank中CDX2基因片段序列(NM_001265)设计如下引物并由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，用PCR方法扩增CDX2。其上游引物：5′-CCGCTCGAGATGTACG-TGAGCTACCTCCTGGACAAGGAC-3′，下游引物：5′-GGGGTACCGTCTGGGTGACGGTGGGG-TTTAGCACCCCCCCAGTTG-3′，扩增片段943 bp；β-actin上游引物：5′-AATCTGGCACCACACCTTCTA-3′，下游引物：5′-ATAGCACAGCCTGGATAGCA-3′，预计扩增片段长度170 bp。反应条件均为25 μL的反应体系，95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，最后72 ℃延伸5 min，最后至4 ℃终止。琼脂糖凝胶电泳观察结果。各组实验重复3次。

2 结 果

2.1CoCl2剂量依赖性抑制LoVo细胞的增殖MTT法检测结果显示CoCl2浓度在100～200 μmol/L时，其对LoVo细胞增殖活力的抑制并不明显；当浓度在300～500 μmol/L范围内时，LoVo细胞的增殖活力受到抑制，且在第5天后更加明显(P<0.05，图1)。

图1不同浓度CoCl2对结肠癌细胞LoVo增殖活力的影响

Fig.1 Effects of different concentrations of CoCl2on proliferation of LoVo cells

2.2重组慢病毒5HhC感染hTERT+LoVo细胞及hTERT-HK-2细胞重组慢病毒5HhC感染hTERT+LoVo细胞及hTERT-HK-2细胞48 h后，免疫细胞化学检测LoVo细胞和HK-2细胞中FLAG的表达，镜下可见LoVo胞质内有棕黄色的FLAG染色颗粒，而HK-2细胞质内无棕黄色颗粒(图2)。由此说明，hTERTp启动子能够调控治疗载体5HhC仅在hTERT阳性细胞中表达，而在hTERT阴性细胞中不表达。

2.3缺氧上调5HhC/LoVo细胞内CDX2蛋白的表达Western blot结果(图3)显示：5HhC/LoVo细胞内CDX2蛋白表达量高于LoVo细胞，且在缺氧环境中更加明显。不同浓度CoCl2(100、200、300、400、500 μmol/L)作用24 h均可上调5HhC/LoVo细胞内CDX2表达量，而在300 μmol/L，24 h时表达量最高，200 μmol/L，24 h时次之，差异具有统计学意义(P<0.05)。5HhC/LoVo细胞内CDX2表达量在300 μmol/L CoCl2作用12、24、36 h后，均明显高于常氧组，且在作用24 h后表达量达到最大(图4)，差异具有统计学意义(P<0.05)。因此，缺氧微环境可以明显上调5HhC/LoVo细胞内CDX2蛋白的表达，且在300 μmol/L CoCl2，作用24 h其上调最明显。

图2免疫组化法检测hTERT+LoVo和hTERT-HK-2细胞中FLAG的表达

Fig.2 Expression of FLAG in hTERT+LoVo and hTERT-HK-2 cells detected by immunohistochemistry (×200)

A：重组慢病毒5HhC感染的LoVo细胞；B：重组慢病毒5HhC感染的HK-2细胞；C：LoVo细胞；D：HK-2细胞。

图3不同浓度CoCl2模拟缺氧微环境下5HhC/LoVo细胞内CDX2蛋白表达

Fig.3 The CDX2 protein expression in 5HhC/LoVo cells under different concentrations of CoCl2

图4CoCl2(300μmol/L)作用不同时间后5HhC/LoVo细胞内CDX2蛋白表达

Fig.4 The CDX2 protein expression in 5HhC/LoVo cells for different time periods with the 300 μmol/L CoCl2

2.4缺氧上调5HhC/LoVo细胞内CDX2mRNA的表达RT-PCR结果(图5)显示：5HhC/LoVo细胞内CDX2 mRNA表达量高于LoVo细胞，且在200 μmol/LCoCl2作用24 h后更加明显(P<0.05)。琼脂糖电泳显示为943 bp大小的特异性条带。以上显示，缺氧微环境通过对5HRE增强子的作用明显上调CDX2基因的表达水平。

图5缺氧微环境对5HhC/LoVo细胞内CDX2mRNA表达的影响

Fig.5 Effect of hypoxia microenvironment on the expression of CDX2 mRNA in 5HhC/LoVo cells

M：1 kb marker；N：DL2000 marker；1：LoVo细胞；2：5HhC/LoVo细胞；3：5HhC/LoVo细胞(CoCl2200 μmol/L 24 h)。

3 讨 论

低氧是实体肿瘤的共同特征，它是癌细胞快速增殖与血液供应相对滞后的结果[9]。近年来微环境低氧与肿瘤的关系倍受关注，低氧通过调控多种基因表达而影响肿瘤细胞的生物学特性，缺氧因子-1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)作为缺氧诱导下最重要的转录因子，参与调控一系列缺氧诱导的靶基因表达[10-11]。HRE是位于低氧相关基因3′或5′端的一段DNA序列，其核心序列可与HIF-1特异结合，形成转录起始复合物，从而启动靶基因的转录[12]。近年来，为了增加目的基因在缺氧微环境下的表达水平，5个拷贝的HRE作为一种增强子，经常被应用于治疗载体的构建。SHIBATA等[13]首先构建了5HRE并研究，发现其在缺氧的微环境下可将调控的靶基因表达水平增加40～50倍。WANG等[14]证明5HRE调控的TSST-1基因的表达在缺氧微环境下能够明显上调。因此，作为增强子，5HRE在缺氧微环境下可以上调目的基因的表达。

分子靶向性基因治疗在肿瘤治疗中具有广阔应用前景，而对于抑癌基因的应用常常因缺乏肿瘤特异性而受到限制，使用肿瘤特异性启动子调控治疗载体的表达克服了该弊端，使得抑癌基因应用于肿瘤的基因治疗成为可能。hTERT启动子由于其在大多数肿瘤细胞中表达，而在正常细胞中不表达[15-17]，使得其在治疗载体的构建中成为一种有用的调控元件。ZHANG等[18]构建了一种hTERT启动子调控的表达载体，使该载体对人肺A549腺癌细胞增殖具有特异性抑制作用，而对正常细胞无影响。有研究者构建了一种hTERT启动子调控的溶菌细胞腺病毒载体，可以有效特异性杀伤人肿瘤细胞，而对人正常体细胞没有作用[19]。这些表明在肿瘤的基因治疗过程中，肿瘤特异性的hTERT启动子提供了一种新途径。

因此，本课题组前期构建了由5HRE增强子和hTERT启动子联合调控抑癌基因CDX2表达的慢病毒表达载体5HhC，并对其进行病毒包装，通过免疫组化法发现hTERT启动子在人结肠癌细胞株LoVo中为阳性表达，而在人肾小管上皮细胞株HK-2中不表达，且筛选获得了稳定表达5HhC的LoVo细胞(5HhC/LoVo)。本实验通过病毒液5HhC感染hTERT+LoVo细胞及hTERT-HK-2细胞，结果发现该治疗载体在LoVo细胞中表达，而在HK-2细胞中不表达，证明了其hTERT靶向性。又通过Western blot检测，发现不同浓度(100、200、300、400、500 μmol/L)的CoCl2作用24 h均可以上调5HhC/LoVo细胞内CDX2的表达，且在300 μmol/L上调最为显著，200 μmol/L次之；在不同的时间点12、24、36 h，CoCl2浓度300 μmol/L作用24 h时，目的基因CDX2具有最高的表达量。RT-PCR检测显示，CDX2 mRNA的表达量在缺氧微环境下(200 μmol/L，24 h)明显增加，与其蛋白水平结果一致。证明了该治疗载体在5HRE增强子作用下，其抑癌基因CDX2在缺氧微环境下的表达量均可明显上调。联合MTT实验显示的不同浓度CoCl2对LoVo细胞的增殖能力的影响，提示200 μmol/L CoCl2浓度既可以明显上调目的基因的表达，且具有较小的细胞毒性，为后续分子及细胞学实验中CoCl2浓度的选择提供了理论依据。

总之，本研究成功的对缺氧诱导的肿瘤特异性基因治疗载体5HhC的hTERT靶向性及缺氧可诱导性进行了鉴定，为后续该治疗载体5HhC在体内及体外的功能研究奠定了基础。

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