谷胱甘肽S转移酶P1基因多态性与新疆维吾尔族慢性阻塞性肺疾病易感性的关系

吴水淼，王妨娥，郭素君，凌 敏，3

(1.新疆石河子大学医学院，新疆石河子 832002；2.新疆生产建设兵团医院呼吸科，新疆乌鲁木齐 830001； 3.新疆维吾尔自治区人民医院呼吸二科，新疆乌鲁木齐 830001)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)的特征为不完全可逆的气流受限。气流受限通常和肺部异常炎症反应的有害颗粒或气体有关，具有高患病率、高致残率、高病死率的特点。目前，COPD是位居世界第4位的死亡原因，并且在不久的将来其发病率、死亡率将持续上升[1]。

目前，多数学者认为，COPD与遗传因素和环境因素及其相互作用有关。环境因素中吸烟是引起COPD的主要危险因素，然而，所有大量吸烟者中只有10%～20%发展成COPD[2]，这表明个体易感性或遗传因素可能发挥作用。氧化酶-抗氧化酶失平衡导致的氧化应激可以损害气道上皮组织和肺间质，增强炎症反应，使促炎症细胞因子基因上调，进而影响COPD的发生和发展。谷胱甘肽S转移酶P1(glutathione S-transferase P1, GSTP1)是肺脏中重要的抗氧化酶，GSTP1基因第5外显子的单核苷酸多态性(A/G)将影响到酶的抗氧化活性。关于GSTP1基因第5号外显子多态性和COPD的研究仍有争议[3-5]。

在本研究中，我们将分析GSTP1基因第5号外显子多态性与新疆维吾尔族慢性阻塞性肺疾病易感性的关系。

1 材料与方法

1.1研究对象选择2011年至2013年在新疆维吾尔自治区人民医院呼吸科住院治疗的新疆维吾尔族COPD患者150例，均符合《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》标准[1]，选择年龄、性别匹配的本院健康体检者150例为对照组，且肺功能符合以下指标：第1秒用力呼气容积/用力肺活量(FEV1/FVC)>70%，FEV1≥80%预计值，两组人群均排除支气管扩张、支气管哮喘、肺部肿块、结核性胸膜炎、胸廓畸形、肺间质纤维化等呼吸系统疾病及其他感染性疾病、外伤及自身免疫性疾病。两组年龄及性别均无统计学差异，具有可比性。两组对象均为无民族间遗传干扰(与其他民族人无通婚情况)、无血缘关系的连续两代及以上长期居住于新疆的维吾尔族人群，所有受试者均签署书面的志愿书。该研究由本单位的伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1标本采集 在清晨空腹时采集研究对象的静脉血2 mL，EDTA抗凝，将抗凝管上下轻轻颠倒8～10次，使血液与抗凝剂充分混合，-20 ℃低温保存。

1.2.2基因组DNA的提取 应用全血基因组DNA快速提取试剂盒(离心柱型)，按北京鼎国生物工程公司提供的说明书方法提取全血基因组DNA。提取的DNA置于-20 ℃保存备用。

1.2.3PCR-RFLP方法检测GSTP1基因多态性 依据文献记录[6]及自己设计合成GSTP1引物(北京鼎国生物工程公司)，GSTP1正向引物5′-GCTCCCCTCCACCCAACCCCAGG-3′，反向引物5′-TGCAGATGCTCACATAGTTGGTGTAGATGAGG-TAG-3′。PCR扩增反应体系：10×PCR buffer(Mg2+free)2 μL，25 mmol/L MgCl 1.5 μL，10 mmol/L dNTP混合物2 μL，10 μmol/L上游引物0.5 μL，10 μmol/L下游引物0.5 μL，Taq酶5 U，50 ng/μL人基因组DNA 1 μL，DMSO 1 μL，ddH2O补足20 μL；所用试剂均购置于北京鼎国生物工程公司。

PCR反应循环程序：95 ℃ 5 min，1个循环；95 ℃ 30 s，65 ℃退火35 s，72 ℃ 40 s，共2个循环；95 ℃ 30 s，63 ℃退火35 s，72 ℃ 40 s，共2个循环；95 ℃ 30 s，61 ℃退火35 s，72 ℃ 40 s，共2个循环；95 ℃ 30 s，59 ℃退火35 s，72 ℃ 40 s，共2个循环；95 ℃ 30 s，57 ℃退火35 s，72 ℃ 40 s，共2个循环；95 ℃ 30 s，55 ℃退火35 s，72 ℃ 40 s，共2个循环；95 ℃ 30 s，53 ℃退火35 s，72 ℃ 40 s，共2个循环；95 ℃ 30 s，51 ℃退火35 s，72 ℃ 40 s，共2个循环；72 ℃ 5 min，1个循环；最后4 ℃保存。

通过20 g/L的琼脂糖凝胶电泳，确定PCR产物扩增出目的条带的质量。

1.2.4扩增片段的限制性内切酶片段长度多态性技术分析 用内切酶AccⅠ对PCR产物进行消化反应。反应体系为：PCR产物2 μL，10×buffer 1 μL，内切酶8 U，用双蒸水补足至10 μL，37 ℃水浴10 h。

酶切产物用33 g/L琼脂糖凝胶电泳，用溴化乙锭染色，利用凝胶成像系统观察结果。

1.3统计学分析直接计数法计算等位基因及基因型频率；采用SPSS 17.0软件进行统计分析。研究对象与基因遗传平衡规律(Hardy-Weinberg平衡)的符合程度采用χ2检验分析；计量资料以均数±标准差表示，计数资料比较采用χ2检验，多因素调整采用Logistic回归分析，计算比值比(odds ratios, OR)和95%可信区间 (confidence intervals, CI)用来检测GSTP1基因多态性和COPD的相关性。所有统计均为双侧，显著性检验水准取α=0.05。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1COPD组与对照组一般资料的比较两组资料在性别和年龄方面差异无统计学意义(男∶女=137∶13、141∶9；平均年龄(岁)：56.5±15.1、54.4±12.3)，两组间吸烟指数差异均无统计学意义(P>0.05)，两组间FEV1预计值及FEV1/FVC差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2GSTP1基因第5外显子的PCR-RFLP结果提取的DNA经过PCR反应扩增出GSTP1基因，基因片段大小约为139 bp(图1)。

图1PCR扩增产物电泳图

Fig.1 The electrophoretogram of PCR amplification product

M：50 bp marker；1～8：PCR产物，大小为139 bp。

GSTP1基因第5外显子PCR-RFLP结果见图2。经PCR扩增后得到139 bp PCR产物，经AccⅠ酶切后，纯合野生型(AA)的PCR产物为139 bp，纯合变异型(GG)的PCR产物被水解为107 bp片段，杂合变异型(AG)型酶切产物则为139、107 bp两个片段。

图2PCR-RFLP的电泳图

Fig.2 The electrophoretogram of PCR-RFLP

M：50 bp marker；1、2、6、7、8、9、10：GSTP1基因纯合野生型；3：杂合变异型；4、5：纯合变异型。

2.3COPD组和对照组基因型和等位基因频率的分布GSTP1第5号外显子105位在两组均以AA基因型为主，AG、GG基因型均较少，两组间的基因型频率比较差异有统计学意义(P=0.013，表1)。

GSTP1第5外显子105位等位基因频率在两组间比较差异有统计学意义(P=0.001)，其中G等位基因频率在COPD组的频率(18.7%)明显高于正常对照组(8.3%，表1)。

表1两组GSTP15号外显子105位氨基酸基因型分布及比较

Tab.1 Comparison of the distribution of 105 amino acids genotype of exon 5 of GSTP1 in the two groups

组 别例数基因型频率AAAGGG等位基因频率AGCOPD组150113(75.3%)18(12.0%)19(12.7%)244(81.3%)56(18.7%)对照组150132(88.0%)11(7.3%)7(4.67%)275(91.7%)25(8.3%) χ28.70213.716 P值0.0130.001

2.4GSTP1第5号外显子105位氨基酸基因型及等位基因与COPD易感性的关系以研究对象是否患COPD为因变量，经Logistic回归分析(协变量包括年龄、性别、吸烟史、AA、AG、GG基因型)，经调整年龄、性别和吸烟史后，COPD组GA等位基因频率(18.7%)高于对照组(8.3%)，可能与COPD的发病风险有关(OR=2.525，95%CI=1.528～4.171)，差异有统计学意义(P=0.001，表2)。

表2维吾尔族人群中基因型及等位基因与COPD易感性的关系

Tab.2 Relationship of genotypes and alleles in the Uighur population with COPD susceptibility

基因及等位基因COPD组(n=150)对照组(n=150)POR95% CI基因型AA1131321AG18110.1080.5230.237～1.154GG1970.0120.3150.128～0.777等位基因G56251A2442750.0012.5251.528～4.171

3 讨 论

在COPD的发病机制中氧化应激和活性氧导致氧化-抗氧化失平衡起着重要的作用。GST作为其中的抗氧化酶在肺部起着保护作用，可以催化各种与还原型谷胱甘肽共轭的电化合物。GSTP1基因外显子5存在多态性，外显子5上为A到G的改变导致蛋白105位上的异亮氨酸(Ile)转变为缬氨酸(Val)，导致GSTP1基因活性缺失，使得毒物代谢不充分，这可能会导致氧化应激[7]。

本研究首次检测了新疆维吾尔族人群COPD患者和对照组的GSTP1的第5外显子基因多态性，提供了新的维吾尔族人群的GSTP1基因多态性和COPD的易感性的关系的新证据。GSTP1第5外显子的基因频率在COPD组和对照组之间比较差异有统计学意义(P=0.013)。GSTP1第5外显子A等位基因频率在两组间比较差异有统计学意义(P=0.001)，其中G等位基因频率在COPD组的频率(18.7%)明显高于正常对照组(8.3%)。这提示维吾尔族人GSTP1 5号外显子G等位基因与维吾尔族人COPD有相关性。

在体外DNA表达研究中提示A到G置换能降低酶的活性。人类肺组织的研究发现GSTP1第5外显子Val降低GSTP1活性[8]。一项包含1 098个受试者的有不同程度肺损害的大样本研究，结果提示在有轻到中度吸烟者中携带GSTP1105位G等位基因的肺功能迅速下降[9]。本研究结果与多数研究一致[10-12]：Val105Val GSTP1和GSTM1纯合缺失型及环氧化物水解酶为COPD的发展过程中的危险因素；而与HARRIES等[13-14]的结论相反。有Meta分析调查了与COPD相关的12个基因20个基因多态性，发现GSTP1Ile105Val仅为亚洲人COPD的保护因素(OR=0.69; 95%CI=0.56～0.85)[15]。

总之，我们发现GSTP1基因等位基因G为新疆维吾尔族COPD的危险因素。本研究COPD患者和健康对照组的例数是相当的，而进一步扩大样本量有助于阐明本病的致病因素。维吾尔族GSTP1分布频率不同于其他地域、种族或民族。本实验数据为进一步研究维吾尔族人群中COPD的发病机制积累了资料和数据，也为研究维吾尔族人群中与GSTP1基因多态性相关的其他疾病提供了基础。

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