束缚应激对小鼠血浆α-klotho蛋白及肾脏α-klotho mRNA表达的影响

杨 伟，苏显明，王 颖，王 瑛，马 奕

(西安交通大学医学院第一附属医院：1. 老年心血管内科；2. 肿瘤内科；陕西西安 710061)

α-klotho是学者在研究盐敏感性高血压小鼠过程中，为观察单基因插入突变所致表型变化而发现的[1]。自从发现该基因以来，学者们做了大量关于其功能的研究。现在已知其表达产物有两种：一种是膜型α-klotho蛋白，为成纤维生长因子的共受体；另一种是分泌型蛋白，其作为内分泌激素，不依赖成纤维生长因子发挥作用[2]。α-klotho功能取决于上述两种蛋白，现在已知其抗衰老效应主要来自膜型蛋白，与参与生物体钙磷代谢调节有关，而分泌型蛋白的功能有待进一步研究。

2004年TAKESHITA等在束缚应激条件下研究α-klotho敲除鼠，发现实验过程中α-klotho敲除鼠较野生型鼠表现出高死亡率(20/30)的特点，死亡的原因为窦房阻滞及窦性停博，非心梗、脑出血等[3]。然而，α-klotho敲除鼠束缚应激过程中死亡原因的机制仍有待阐明。基于上述研究，我们提出这样一种假设：束缚应激改变了野生型小鼠分泌型或膜型α-klotho蛋白的含量，正是这种α-klotho蛋白含量的变化致使下游信号转导通路能缓冲应激所致内环境的有害刺激。而α-klotho敲除鼠缺乏这种缓冲有害刺激的能力，最终死于病态窦房结综合征。

因此，这个假设能否成立的前体条件在于束缚应激能否改变膜型或分泌型α-klotho蛋白的含量或α-klotho mRNA的表达。本文就束缚应激对α-klotho的影响进行了研究。

1 材料与方法

1.1实验材料C57BL6/J小鼠(由西安交通大学医学院实验动物中心提供，SYXK(陕)2007-003)；肝素钠(海通药业有限公司，成都，中国)，离心机(Eppendorf 5415R，纽约，美国)；RNAiso Plus(TaKaRa公司，大连，中国)，PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser(TaKaRa公司，大连，中国)，iCycler iQ5TMReal Time PCR detection system(Bio-Rad Laboratories，加利福利亚，美国)，SYBRPremixExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus) (TaKaRa公司，大连，中国)，Enzyme-linked Immunosorbent Assay Kit(USCN公司，武汉，中国)，分光光度计(FLUOstar OPTIMA，奥芬堡，德国)，SPSS for Windows Release 19.0(SPSS，芝加哥，美国)。

1.2实验动物分组及饲养实验动物为5周龄雄性C57BL6/J小鼠(约17 g)，共48只。实验动物随机分为6组，每组8只共同饲养在一个通气良好的饲养笼内，饲养室温度保持在(16±1)℃，相对湿度在(55±5)%，行春季自然光照节律。在进行实验(6周，约20 g)前所有动物先适应预实验环境1周，随意给予食物和水。

1.3应激实验的实施方案束缚应激组小鼠均置于水平放置的50 mL锥形离心管中，离心管置于镂空的饲养架上，离心管管周开密集通风口(通风口不宜过大，以防小鼠试验中破坏管壁逃跑)保持良好通气，限制其身体自由移动，试验中远离食物及水，避免实验过程中人为及机械的各种噪音，保持周围环境温度及湿度相对恒定等，以控制实验干预因素以外的应激因素。对照组小鼠实验过程中脱离原饲养环境，置于无垫料、食物及水源的空饲养盒内，其他条件均与束缚应激组保持一致。

应激实验进行阶段，所有动物远离水和食物。20 h 组实验开始于第1天中午12点结束于次日晨8点；10 h组实验开始于晨8点至下午6点；1 h组实验开始于中午12点至下午1点。

1.4标本采集束缚应激实验结束后，在2 min内立即从眶上静脉途径采血，血液存储于行肝素抗凝的EP管中，置于EP管中的血液于Eppendorf 5415R离心机中离心，离心参数为4 ℃，1 500×g，15 min。血标本采集后，立即麻醉处死小鼠后取出双侧肾脏，生理盐水冲洗后，于液氮中速冻，后储存于-80 ℃冰箱备用。

1.5肾脏α-klothomRNA表达变化的检测用RNAiso Plus提取肾脏总RNA后，取0.8 μg总RNA利用PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser进行反转录，反转录所得cDNA片段包含位于第3个外显子的选择性剪切位点。为确定α-klotho mRNA表达水平，实验中使用了实时定量PCR，反应体系为25 μL(包含2 μL的模板cDNA，1 μL各条引物，12.5 μL的SYBR Premix ExTaqTMⅡ)，使用Gapdh作为内参基因，反应条件为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s 40循环，60 ℃ 30 s。引物序列如表1所示。

表1RT-PCR引物序列及扩增产物片段大小

Tab.1 Primers used for quantitative real-time PCR

引物名称序列(5'→3')扩增产物片段(bp)α-klotho primer 1α-klotho primer 2CGCAAAGTGCTCAACTGGCTAAAAGGTTGATGTCGTCCAACACGTA150Gapdh primer 1Gapdh primer 2TGTGTCCGTCGTGGATCTGATTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG171

PCR产物扩增的特异性经溶解曲线及琼脂糖凝胶电泳确定。使用2-ΔΔCT方法计算mRNA表达水平。

1.6血浆α-klotho蛋白及皮质酮浓度的测定血浆α-klotho蛋白和皮质酮水平均采用酶联免疫吸附试剂盒测定，在(450±10)nm波长下于FLUOstar OPTIMA分光光度计中测定样本吸光度，据标准品吸光度及浓度绘制标准曲线，后据标准曲线计算出各样本浓度。

2 结 果

2.1动物模型符合应激实验的要求本研究采用经典的束缚应激实验模型，来研究应激对α-klotho蛋白及基因表达的影响。为评估实验模型的有效性，消除昼夜节律对血皮质酮浓度的影响，实验中引入监控应激强度检测指标-皮质酮及设立对照组，实验组与对照组均测定皮质酮水平。既往研究资料表明，如果小鼠皮质酮水平较无应激状态高2倍以上，应激强度即符合要求，达到应激处理的目的。虽然在束缚应激组与对照组中，血浆皮质酮浓度与现有研究数据有差距，但各束缚应激组较其对照组倍数变化关系有意义，1、10、20 h束缚应激组较各自对照组血浆皮质酮浓度变化倍数依次为2.03、2.52和2.34，说明应激强度符合要求，实验模型建立成功。束缚应激组与对照组皮质酮水平如图1所示。

图1不同处理时间组组内皮质酮质量浓度变化的比较

Fig.1 Comparison of corticosterone concentration in different treatment time subgroups

与各组内对照组比较，*P<0.05。

2.2束缚应激增高血浆α-klotho蛋白质量浓度基于上述小鼠束缚应激模型的评估结果，后续实验均采用上述应激实验方案。目前，关于血浆α-klotho质量浓度的正常范围尚无统一研究结果，且不同研究得出不尽相同的结论[4]。本实验所测得血浆α-klotho质量浓度与另一研究的结果(10 nmol/L到50 nmol/L)[5]部分一致。1、10 h和20 h对照亚组血α-klotho蛋白浓度分别为(757.71±333.93)、(687.38±342.79)、(912.90±337.8)pg/mL；束缚应激亚组分别为(726.40±342.79)、(1 261.54±442.71)、(1 696.18 ± 404.11)pg/mL。对照亚组各组之间血α-klotho蛋白质量浓度无统计学差异，但20 h组较其他两组稍高。1 h束缚应激亚组与对照亚组间无统计学差异，而10 h与20 h束缚应激亚组血α-klotho蛋白与其各自对照亚组间有统计学差异(P<0.05)。不同处理时间组血浆α-klotho蛋白质量浓度的变化情况如图2所示。

图2不同处理时间组血浆α-klotho蛋白质量浓度的变化

Fig.2 Comparison of serum α-klotho protein concentration in different treatment time groups

与组内对照组比较，*P<0.05；与1 h束缚应激组比较，#P<0.05。

2.3束缚应激使肾脏α-klothomRNA的表达减低PCR的扩增曲线、溶解曲线及扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图3、图4所示。

图3α-klotho基因(A)和Gapdh基因(C)的扩增曲线及α-klotho基因(B)和Gapdh基因(D)的溶解曲线

Fig.3 Fluorescent curves of α-klotho (A) and Gapdh (C), dissociation curves of α-klotho (B) and Gapdh (D)

我们观察到肾脏α-klotho mRNA的表达在束缚应激进行1 h的时候已经轻微降低了，但这种改变尚无统计学意义(P>0.05)。显著降低发生在10 h与20 h束缚应激组，肾脏α-klotho mRNA表达较空白对照组分别减低2.02倍和2.46倍(表2)。

图4小鼠肾脏α-klotho和Gapdh的RT-PCR结果

Fig.4 RT-PCR products of α-klotho and Gapdh in mice renal tissues

1～4：Gapdh的RT-PCR结果(片段长度为171 bp)；5～8：α-klotho RT-PCR结果(片段长度为150 bp)；M：Marker。

表2不同处理时间组肾脏α-klothomRNA表达变化的比较

Tab.2 Comparison of the expression of renal α-klotho mRNA in different treatment time groups

组 别ΔCT1(kla-Gapdh)ΔCT2(klb-Gapdh)ΔΔCT(ΔCT1-ΔCT2)束缚应激组较其对照组表达减低倍数1h组4.91±0.384.74±0.500.171.1310h组6.58±0.205.77±0.301.012.02#20h组6.59±0.595.29±0.361.302.46#

Gapdh：内参CT值；kla：束缚应激组CT值；klb：对照组CT值；#P<0.05，与1 h束缚应激组比较。

3 讨 论

研究表明，应激主要通过下丘脑-垂体-肾上腺轴，交感-肾上腺髓质轴及阿片系统发挥作用。TAKESHITA等[3]研究表明，在束缚应激条件下野生型小鼠血浆去甲肾上腺素增高，而α-klotho敲除鼠血浆去甲肾上腺素水平却轻度降低。许多学者都曾研究过皮质酮这一鼠类主要的应激激素，结果表明应激使血浆皮质酮浓度显著增高[6]，同时皮质酮能诱导胰岛素抵抗[7]。而诸多研究表明对胰岛素/胰岛素样生长因子1信号转导通路的适当抑制能延长动物寿命，α-klotho正是通过这一方式发挥抗衰老作用的[8]。在这种情形下，因α-klotho 与皮质酮存在诱导胰岛素抵抗这一共同点，故α-klotho与皮质酮或其他应激激素之间在抗衰老方面是否存在关系，需要更多更深入的研究来阐明。

本研究所用束缚应激模型为急性束缚应激模型，束缚应激过程中出现血浆α-klotho蛋白浓度增高的现象，故支持α-klotho蛋白作为一种急性期蛋白，但其具体功能尚待进一步研究阐明。这一现象表面上看来与肾脏组织α-klotho mRNA表达减低相矛盾，推测其原因为以下3个方面：①分泌型α-klotho有两种生成方式：α-klotho mRNA选择性拼接后表达和膜型α-klotho胞外域直接从膜上脱落形成[9]。如果是第1种生成方式，那么血浆中α-klotho浓度的升高，必然伴随α-klotho mRNA表达的升高，但事实却是表达减低，故推测出现血α-klotho蛋白浓度升高，而主要表达α-klotho的肾脏组织α-klotho mRNA减低，这一看似矛盾现象的原因是α-klotho存在第2种生成方式，这也与现有研究结果一致。分泌型α-klotho的产生主要来自膜型α-klotho蛋白胞外域的脱落，故推测束缚应激主要是通过增加膜型α-klotho蛋白的脱落从而提高血浆α-klotho蛋白浓度，发挥急性期蛋白的相关作用。解释了这一看似矛盾的现象后，仍有两个问题有待解决：束缚应激是如何促使膜型α-klotho胞外域脱落及下调肾脏组织α-klotho mRNA表达的，前面我们探讨了应激现象的作用轴，故我们推测作为啮齿类动物的小鼠，皮质酮为其主要的应激激素，束缚应激有可能通过改变血浆皮质酮及其他应激激素浓度，从而出现相应改变，这仍待进一步实验验证。②有学者研究发现FGF-23能直接或间接增加血α-klotho蛋白浓度及减低α-klotho mRNA的表达[10]，但束缚应激能否改变FGF-23的浓度及机制仍有待阐明。③研究表明持续的循环压力如高血压，糖尿病和由氧化应激、代谢紊乱及脂多糖诱发的急性炎症都能下调α-klotho的表达[11]。

在本研究中，我们观察到小鼠在束缚应激过程中表现出大量出汗及因恐惧小便失禁等现象。我们认为即使因出汗导致低血容量的发生，机体应激所致血流再分配，也与肾脏α-klotho mRNA表达减低没有关系，因现有研究表明通过放血所致低血容量未下调α-klotho mRNA的表达，但有可能与血流重新分配，致肾脏相对缺血缺氧，从而导致局部组织代谢紊乱，加重氧化应激有关系，因现有证据表明氧化应激可下调α-klotho mRNA的表达[12]。

综上所述，束缚应激可能是通过改变皮质酮、肾上腺素等浓度，再通过某一作用方式作用于肾脏膜型α-klotho蛋白，导致膜型α-klotho胞外域脱落，从而暂时升高血浆α-klotho蛋白浓度，而血α-klotho蛋白浓度的改变又进一步影响窦房结功能。

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