自发性高血压大鼠海马区MCP-1、COX-2、NF-κB表达及神经元损伤的增龄性变化

李雅丽，张巧俊，袁海峰，张 妮，郭方圆，牛小麟，罗 昆

(1.西安交通大学医学院第二附属医院脑病科，陕西西安 710004；2.西安交通大学医学院 第二附属医院心血管内科，陕西西安 710004；3.西安市儿童医院，陕西西安 710003)

高血压可致靶器官结构损伤和功能障碍，是脑卒中的主要危险因素。既往对高血压脑损伤的关注多集中于脑血管病变导致脑卒中后出现的脑组织结构和功能改变，而高血压在并发脑卒中前就已经存在一定的高级神经功能障碍，主要表现为认知功能损害。因此，脑卒中前高血压脑损伤研究已逐渐引起学者关注。近年来，研究显示慢性炎症是高血压病理进展的一个重要机制，在高血压脑损伤中扮演重要角色，炎症因子如IL-1b等通过各自的下游信号通路，可引发神经元损伤甚至死亡[1]。但是，目前尚无关于高血压脑内炎症通路的增龄性活化及损伤的研究及报道。探讨高血压脑损伤过程中的炎症反应机制，将为其治疗开辟新的道路。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组健康雄性自发性高血压大鼠(SHR)和威斯塔京都大鼠(WKY)各15只，均购自上海SLAC实验动物中心。随机分为3组，每组5只：16周龄(16周)组、32周龄(32周)组和64周龄(64周)组。标准环境下饲养，室温20～25 ℃，24 h昼夜循环光照，自由摄食饮水，到达相应周龄时，尾动脉测压后处死取脑。

1.2主要试剂B-巯基乙醇、TEMED购于Sigma公司；Sample protectors、RNAiso、PrimeScript RT Master Mix、SYBR Premix ExTaqTMⅡ均购自TaKaRa公司。NF-κB兔抗大鼠、β-actin小鼠抗大鼠多克隆抗体均购自Bioworlde公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗、山羊抗小鼠二抗及ECL试剂盒购自Amersham公司。

1.3方法

1.3.1大鼠尾动脉测压 大鼠在正式实验前，进行为期1周的尾动脉测压预适应，然后将tail-cuff压力换能器与多导生理记录仪相连，调整标压，将tail-cuff压力换能器缠绕于待测大鼠尾根部，充气后测量各组大鼠尾动脉收缩压。

1.3.2标本收集及测定 各组大鼠达相应周龄尾动脉测压后，腹腔注射100 g/L水合氯醛(500 mg/kg)，麻醉后处死，冰上剥离鼠脑。用预冷的生理盐水洗净表面血液并吸干残留水分后，一部分贮存在标本保护液(sample protector, TaKaRa)，液氮中保存以便进行Real time PCR及Western blot检测。另一部分迅速贮存在预冷的新鲜40 g/L多聚甲醛中，4 ℃过夜，石蜡包埋，用于甲苯胺蓝染色检测。

1.3.3甲苯胺蓝染色 切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ和梯度乙醇脱蜡入水，甲苯胺蓝染色10 min，700 mL/L乙醇分色，梯度酒精脱水，二甲苯透明后，中性树胶封片，显微镜下观察并拍照。观察每只大鼠海马CA1区神经元数量，每个大鼠3张切片，选取层面为前囟后3.72～3.96 mm，40倍目镜下随机取5个视野，图像分析仪(Q550CW，德国莱卡公司)计数单位面积神经元数量。

1.3.4Realtime FQ-PCR分析 Trizol法提取各组大鼠海马区总RNA，PrimeScript RT Master Mix盒子(TaKaRa)反转录成cDNA。用SYBR Premix ExTaqTMⅡ Kit(TaKaRa)进行Realtime FQ-PCR实验。MCP-1(上游序列：5′-CTATGCAGGTCTCTGTCACGCTTC-3′，下游序列：5′-CAGCCGACTCATTGGGATCA-3′)、COX-2(上游序列：5′-CGGAGGAGAAGTGGGGTTT-3′，下游序列：5′-GTTGATGGTGGCTGTCTTGG-3′)和β-actin(上游序列：5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游序列：5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′)，序列均由TaKaRa公司设计并合成。在iQ Multicolor Real-Time PCR Detection system(Bio-Rad, Hercules, CA)仪器进行Realtime FQ-PCR实验。每个基因的mRNA水平都用其β-actin mRNA水平来调整。Ct值由Bio-Rad iQ5 2.0标准edition optical 系统软件获得，并用2-△△Ct法分析。每组3个样，进行3次独立实验。

1.3.5Western blot检测 从Sample protector里取出海马组织后提取蛋白质，BCA测试盒测定各组蛋白质浓度，并调整一致，蛋白变性后制取120 g/L琼脂糖凝胶，各组等量上样进行电泳，电泳完毕后，将蛋白转移到NC膜上。100 g/L脱脂奶粉封闭，加入兔抗大鼠NF-κB(1∶1 000，Bioworlde)及小鼠抗大鼠β-actin(1∶1 000，Bioworlde)多克隆抗体，4 ℃过夜。TBST洗涤3次后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(羊抗兔或羊抗小鼠IgG)孵育，ECL化学发光法发光，X光片记录结果。蛋白条带进行相对密度扫描并分析。

2 结 果

2.1血压监测结果对SHR、WKY组大鼠达16、32、64周龄时进行尾动脉测压，结果显示，不同周龄SHR组大鼠SBP均较同龄WKY组大鼠明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。SHR组3个年龄段间比较，32周、64周组较16周组SBP均明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，但32周和64周两组之间比较差异无统计学意义。不同周龄WKY组之间SBP比较，差异无统计学意义(表1)。

表1各组大鼠血压检测结果

Tab.1 The results of blood pressure in different groups

mmHg)

与WKY组比较，*P<0.01；与16周SHR组比较，**P<0.01。2.2各组大鼠海马CA1区尼氏染色结果高倍镜下观察，各组大鼠海马CA1区神经元胞核着色不明显，核内有1～3个深蓝色核仁，周围胞质内可见染成蓝色的颗粒状物质，即为尼氏小体。SHR、WKY组神经元数目均呈现增龄性递减趋势，其中，16周SHR、WKY组大鼠海马CA1区神经元胞质内尼氏小体数量较多、染色较深；随增龄，32周、64周SHR组海马CA1区神经元尼氏小体数量减少、染色变淡，呈现不同程度的溶解，提示其神经元存在损伤(图1)。

图1各组大鼠海马CA1区尼氏染色结果

Fig.1 Nissl’s staining of CA1 subfield of the hippocampus in different groups (×400, Bar=50 μm)

A、B、C：SHR组16周、32周和64周；D、E、F：WKY组 16周、32周和64周。

比较各组大鼠海马CA1区单位面积的神经元数目，可以观察到，SHR和WKY组单位面积神经元数目随增龄均逐渐减少，SHR组更为显著。32周和64周SHR组单位面积神经元数目均明显少于16周组，差异有统计学意义(分别为P<0.05，P<0.01)，64周较32周组差异也有统计学意义(P<0.01)。而WKY组中，64周较16周组单位面积神经元数目也明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)。与同年龄WKY组相比，32周、64周SHR组单位面积神经元数目均显著减少，差异有统计学意义(分别为P<0.05，P<0.01，图2)。

2.3海马区COX-2、MCP-1mRNA的表达水平如图3所示：SHR组COX-2、MCP-1 mRNA表达水平均呈现增龄性升高趋势，32周、64周SHR组COX-2、MCP-1 mRNA表达水平均较16周SHR组明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，但32周和64周两组之间COX-2 mRNA表达差异无统计学意义，MCP-1 mRNA表达差异有统计学意义(P<0.05)。较同年龄WKY组，32周和64周SHR组COX-2、MCP-1 mRNA表达水平均明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。此外，可以观察到，64周WKY组COX-2、MCP-1 mRNA表达水平均较16周WKY组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

图2各组大鼠海马CA1区单位面积神经元数目比较

Fig.2 Comparison of the number of neurons in CA1 subfield of the hippocampus in different groups

与16周SHR组比较，#P<0.05；与32周SHR组比较，##P<0.01；与同周龄WKY组比较，*P<0.05，*P<0.01；与16周WKY组比较，△P<0.05。

图3各组大鼠海马组织中COX-2、MCP-1mRNA表达水平的比较

Fig.3 Comparison of COX-2 and MCP-1 mRNA expressions in the hippocampus of different groups

与16周SHR组比较，#P<0.01；与32周SHR组比较，##P<0.05；与同周龄WKY组比较，*P<0.01；与16周WKY组比较，△P<0.05。

2.4海马区NF-κB蛋白表达的水平如图4所示，SHR、WKY组海马区NF-κB蛋白表达水平呈现随增龄而逐渐升高趋势。SHR组间两两相较差异均有统计学意义(P<0.01)；WKY组间相较，64周较16周组NF-κB蛋白表达升高，差异有统计学意义(P<0.01)。较同年龄WKY组，32周和64周SHR组NF-κB蛋白表达水平均显著升高，差异有统计学意义(分别为P<0.05，P<0.01)。

图4各组大鼠海马组织中NF-κB蛋白表达水平比较

Fig.4 The protein expression of NF-κB in the hippocampus of different groups

与16周SHR组比较，#P<0.01；与32周SHR组比较，##P<0.01；与同周龄WKY组比较，△P<0.05、*P<0.01；与16周 WKY组比较，&P<0.01。

3 讨 论

卒中前高血压脑损伤研究已逐渐引起学者关注，其主要病理变化为长期慢性缺血缺氧所致的神经元凋亡，累及与学习、记忆密切相关的脑区。但既往对高血压脑损伤的研究多集中在某一年龄段，系统报道高血压脑损伤增龄性变化的研究较少。COX-2和MCP-1作为炎症反应的重要生物学指标，在多种疾病中发挥重要作用，但有关其在高血压脑损伤中的作用却少见报道。NF-кB在多种疾病中参与对炎症介质的调控，其是否参与高血压脑损伤并对参与其中的炎症介质具有调控作用？本研究以SHR作为研究对象将就如上疑问进行探讨。

SHR出生时血压正常，在3～6个月时发展为持续高血压，其时间依赖性的动脉血压升高、脑萎缩、神经细胞缺失、胶质细胞反应的出现都与人类原发性高血压有相似的特征，是一种研究高血压脑损伤的合理模型[2]。有研究发现，长期高血压主要累及额叶、枕叶皮质、海马等与学习记忆能力密切相关的脑区[3]，随高血压状态持续，海马CA1、CA3区及齿状回体积逐渐缩小，神经元丢失范围逐渐扩大[4]。本实验发现，较同年龄配对WKY组，32周、64周SHR组海马CA1区神经元细胞明显减少，64周组更显著。提示随年龄增加、血压升高，海马CA1区神经元缺失逐渐增多，这可能是中、老年高血压患者认知下降的细胞学基础。选用同年龄配对的WKY组作为对照，剔除了年龄等混杂因素干扰。结果证实，高血压是海马CA1区神经元减少的独立危险因素。有学者为剔除年龄对记忆功能的影响，选择中年高血压患者作为研究对象，发现其记忆功能较对照组明显减退，提示高血压是记忆障碍的独立危险因素[5]。本结果与此一致。但是，我们也观察到，无高血压的WKY组3个年龄段之间比较，64周较16周组神经元数目有所减少。已知64周大鼠约相当于人类的中老年阶段，推测衰老可能是64周WKY组神经元减少的主要原因。这也与既往研究结果一致。随衰老进行，海马组织抗氧化能力降低，海马CA1区锥体细胞出现退行性变化[6]，提示衰老也是神经元凋亡的独立危险因素。特定脑区的神经元数目与神经系统接收、分析及贮存信息的能力可能相关，在SHR及老年WKY大鼠中观察到的海马区更少的神经元数目提示其脑功能可能正在发生进行性损伤。

COX-2是合成前列腺素过程中最重要的限速酶，脑组织中含量最高，主要在海马和颞叶皮质的神经细胞膜上低水平表达。多种病理刺激、细胞因子能够诱导COX-2过度表达，并通过介导炎症反应参与组织损伤。近年来，有研究证实COX-2与高血压发生关系密切，可加重高血压患者体内氧化应激损伤[7-8]。本研究观察到32、64周SHR组海马区COX-2表达水平显著高于同周龄WKY组，提示COX-2可能在高血压引发脑损伤过程中发挥着重要作用。这与以往有关COX-2与脑损伤关系的研究结果一致。有研究证实，COX-2的表达水平在急性脑缺血大鼠[9]与慢性脑缺血老龄大鼠[10]脑组织中明显升高，提示COX-2广泛参与缺血后炎症反应所致的脑组织损伤。MCP-1属于趋化因子，可由单核-巨噬细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞等多种细胞分泌。作为炎症反应进程中的重要环节，MCP-1可趋化炎症细胞转移至炎症部位，并激活炎症细胞使其合成释放大量炎症介质，引发组织受损[11]。近来，有临床试验研究高血压与炎症标志物的关系，发现MCP-1随高血压进展持续升高[12]。本研究中SHR各周龄组COX-2、MCP-1表达水平变化呈现增龄性升高趋势，提示随增龄，高血压脑内炎症损伤增强，这可能是海马CA1区神经元减少的分子生物学基础。

有研究发现，多种炎症介质如COX-2、MCP-1、IL-1、IL-6的基因启动子上均存在NF-κB的结合位点，当NF-κB与之结合后，基因即被激活开始转录表达[13]。RODRIGUEZ等[14]发现SHR体内NF-κB蛋白水平升高，多种组织内有明显的炎症细胞浸润，而腹膜注射NF-κB抑制剂PDTC(烷二硫代氨基甲酸)，可使NF-κB蛋白水平恢复正常，组织间未见明显炎症细胞浸润，提示NF-κB可能通过调控炎症介质释放参与了高血压组织损伤。本研究发现，与MCP-1、COX-2 mRNA表达变化一致，SHR组内NF-κB表达随增龄逐渐升高，且32周、64周SHR组NF-κB蛋白表达均较同龄WKY组明显升高，提示NF-κB可能对COX-2、MCP-1的表达具有调控作用。表达上调的NF-κB与COX-2和MCP-1的基因启动子结合，使COX-2和MCP-1基因激活后转录表达水平上调，从而参与了高血压海马区神经元损伤过程。

总之，在高血压脑损伤中，炎症介质COX-2、MCP-1发挥着重要作用，且COX-2与MCP-1可能具有共同的调控机制。NF-κB在高血压脑损伤中扮演着重要角色，可能对COX-2和MCP-1的表达起调控作用，有可能成为治疗高血压脑损伤新的干预靶点。

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