陕西人群环氧化酶-2(COX-2)启动子区基因多态性及与结直肠癌易感性的关联研究

李红霞，郭秦乐，周 博，和水祥

(西安交通大学医学院：1. 第一附属医院消化内科；2. 生理学与病理生理学系，陕西西安 710061)

环氧化酶(cyclooxygenase-2, COX)是催化花生四烯酸转化为前列腺素的限速酶。COX作为合成前列腺素E2过程中的重要限速酶，对肿瘤的发生发展具有重要调节作用。目前相关研究已证实，COX-2在结直肠癌(colorectal cancer, CRC)、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤中均有过表达，COX-2过表达参与细胞增殖、血管形成、肿瘤转移及抑制细胞凋亡等多种病理过程[1-2]。

CRC是我国常见的消化道恶性肿瘤之一。研究表明，基因的遗传多态性是导致不同个体对环境因素反应性差异并引发CRC的重要原因，而COX-2基因多态性作为一个潜在因素影响着CRC的进展及治疗[3]。因此，探讨COX-2启动子区的基因多态性与CRC发生的相关性有重要的理论意义。本研究采用病例-对照的方法，用聚合酶链式反应和限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)技术对陕西人群COX-2基因rs2745557和rs20417位点的基因多态性与CRC发生的相关性进行研究，旨在探讨COX-2基因多态性与CRC易感性及发生发展的关联。

1 材料与方法

1.1主要试剂DNA提取试剂盒购自中国天根生化科技(北京)有限公司；引物由上海Sangon Biotech股份有限公司合成；DNA聚合酶由大连TaKaRa公司提供；限制性内切酶AciⅠ和Taqα购自美国NEW ENGLAND BioLabs公司；50 bp marker购自美国TaKaRa公司。

1.2病例与分组2011年10月至2013年6月在西安交通大学医学院第一附属医院进行手术并经病理确诊的CRC患者198例设为病例组，所入组患者长期居住地为陕西省西安市及周边县、市，均为首次住院手术，既往未发现肿瘤病史，未行相关的放疗及化疗。男107例，女91例，年龄36～80岁，中位年龄60岁，其中结肠癌93例(46.96%)，直肠癌105 例(53.03%)。临床分期采用国际抗癌协会(UICC)1987年的TNM分期法，Ⅰ～Ⅱ期患者111例(56.06%)，Ⅲ～Ⅳ期患者87例(43.94%)；无淋巴结转移者为116例(58.6%)，有淋巴结转移者为82例(41.4%)。采用随机数字表法随机抽取200名同期到医院参加健康体检的志愿者为健康对照组，男112例，女98例，年龄35～76岁，中位年龄65岁，所选病例组及对照组均来自陕西西安市及周边市县。

对研究人群的基本资料如吸烟、饮酒、饮食习惯、精神状况、肿瘤家族史等进行问卷调查并收集资料。收集研究人群的CRC的病理资料。

1.3标本采集及基因组DNA提取经研究对象知情同意后，采集静脉血3 mL于EDTA抗凝管中，离心去血清后在剩下的细胞中加入300 mL人红细胞裂解液，混匀震荡3 min溶解红细胞，离心30 s沉淀白细胞，加入细胞裂解液后按TIANGEN公司说明书提取DNA。

1.4COX-2基因多态性检测采用PCR-RFLP技术分析COX-2基因启动子区的位点rs20417 G/C及rs2745557 G/A位点的基因多态性. PCR扩增的引物序列依次为：COX-2 rs20417 primer F：5′-TTTAGCGTTTGTCCATCAGAAG-3′，R：5′-GGGGC-GAGTAAGGTTAAGAAA-3′；COX-2 rs2745557 primer F：5′-TCAGCCATACAGGTGAGTACC-3′，R：5′-CTGGGAGCAGGAAAGAACTG-3′。2个PCR反应体系均为50 μL，包括以下组分：10×Buffer 5.0 μL，MgCl23.0 μL，dNTPs 4.0 μL，上下游引物各4.0 μL，DNA聚合酶10 U，模板50 ng，灭菌双蒸馏水补足反应体积至50 μL。扩增条件为激活95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，52.4 ℃(COX-2 rs2745557)或48.4 ℃(COX-rs20417)30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环，之后72 ℃ 7 min，4 ℃。

PCR产物分别用AciⅠ和Taqα限制性内切酶酶切，体系均为PCR产物10 μL，酶10 U，10×Buffer Tango 3.0 μL，灭菌双蒸馏水补足反应体积至30 μL，水浴37 ℃过夜。30 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定结果，同时选取10%样本进行重复检测。

1.5COX-2多态性基因频率与临床病理参数的相关性分析将COX-2多态性基因频率及分布情况与研究人群的CRC的病理资料进行相关分析。

1.6统计学处理运用SPSS 11.0软件进行统计学分析。计算各组等位基因和基因型频率的分布,卡方检验分析各组等位基因和基因型频率分布的差异, 并通过比数比(OR)计算进行相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1CRC组与对照组的人群基本特征的比较CRC组年龄≥65岁的分布频率高于健康对照组(54.0%vs. 37.5%，P<0.05)，有吸烟史、饮酒史及肿瘤家族史者的分布频率均高于健康对照组(52.5%vs. 41.5%，P<0.05；39.4%vs. 29.0%，P<0.05；18.2%vs. 9.5%，P<0.05)，而各组间的性别构成差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

表1CRC组与对照组的人群基本特征的比较

Tab.1 Basic clinical characteristics in CRC group and control group[n(%)]

*P<0.05。

2.2COX-2基因启动子区rs20417及rs2745557位点的PCR扩增的酶切分析COX rs20417位点的PCR产物为357 bp，经AciⅠ酶切电泳后可见产生111、245 bp 2个片段的GG型，产生111、245、357 bp 3个片段的GC型，及产生357 bp的CC型(图1)。COX-2 rs2745557位点的PCR产物为400 bp，经Taqα酶切后可见仅有400 bp的AA基因型，含有161、238、400 bp 3个片段的GA基因型，含有161、238 bp 2个片段的GG基因型(图2)。计算以上位点的多态性基因型分布，经检验对照组基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡，可认为研究人群来自于平衡群体，具有群体代表性。

图1CRC组COX-2rs20417G/C位点基因多态性PCR-RFLP分析

Fig.1 SNPs of COX-2 rs20417 G/C by PCR-RFLP

图2CRC组COX-2rs2745557G/A位点基因多态性PCR-RFLP分析

Fig.2 SNPs of COX-2 rs2745557 G/A by PCR-RFLP

2.3COX-2基因rs20417及rs2745557位点的基因型分布以及与CRC相对风险性分析在控制了年龄、性别、吸烟、饮酒及家族史因素后，COX-2 rs20417 G/C 多态性位点的3种基因型GG、GC和CC在健康对照组中的分布频率为29.0%、34.5%、36.5%，在CRC组的分布频率为20.2%、39.4%、40.4%。以COX-2 rs20417 GG基因型(野生型)为对照，CRC组中的GC基因型(杂合突变型)和CC基因型(纯合突变型)分布频率与健康对照组比较差异无明显统计学意义(P>0.05)，而GC+CC基因型频率在CRC的分布频率差异有统计学意义(OR=1.61；95%CI: 1.02～2.56，表2)。

表2COX-2rs20417G/C与CRC的关系

Tab.2 Frequency distribution of COX-2 rs20417 G/C in CRC group and control group [n(%)]

在控制了年龄、性别、吸烟、饮酒及家族史因素后，COX-2 rs2745557 G/A多态性位点的3种基因型GG、GA和AA在健康对照组中的分布频率为27.0%、35.0%、38.0%，在CRC组的分布频率为16.2%、41.4%、42.4%。以COX-2 rs20417 GG基因型(野生型)为对照，CRC组中的GA基因型(杂合突变型)和AA基因型(纯合突变型)分布频率与健康对照组比较，差异有明显统计学意义(GA型：OR=1.98，95%CI：1.15～3.40；AA型：OR=1.87，95%CI：1.09～3.19)，同时GA+AA基因型频率在CRC的分布频率的差异有统计学意义(OR=1.92，95%CI：1.18～3.13，表3)。

表3COX-2rs2745557G/A与CRC的关系

Tab.3 Frequency distribution of COX-2 rs2745557 G/A in CRC group and control group [n(%)]

2.4COX-2rs20417及rs2745557位点的多态性基因频率与淋巴结转移、CRC分期病理参数及发病部位的相关性分析COX-2 rs20417 G/C基因多态性分析显示，淋巴结转移率GG基因型9/82(11.0%)，GC基因型20/82(24.4%)，CC基因型53/82(64.6%)，差异有统计学意义(P<0.01)；GG基因型Ⅲ～Ⅳ期占11/87(12.6%)，GC基因型Ⅲ～Ⅳ期占22/87(25.3%)，CC基因型Ⅲ～Ⅳ期占54/87(62.1%)，差异有统计学意义(P<0.01)，统计结果提示，COX-2 rs20417 G/C基因多态性与肿瘤淋巴结转移、TNM分期较晚密切相关，而与CRC的发病部位没有明显相关性(P=0.27，表4)。

COX-2 rs20417 G/A基因多态性分析结果显示，淋巴结转移率GG基因型7/82(8.5%)，GA基因型20/82(24.4%)，AA基因型55/82(67.1%)，差异有统计学意义(P<0.01)；GG基因型Ⅲ～Ⅳ期占9/87(10.3%)，GA基因型Ⅲ～Ⅳ期占22/87(25．3%)，AA基因型Ⅲ～Ⅳ期占56/87(64.4%)，差异有统计学意义(P<0.01)。统计结果提示，COX-2 rs2745557含有A等位基因的GA或AA基因型相对于GG基因型，淋巴结转移以及肿瘤分期差异显著，而与发病部位无显著相关(P=0.56，表5)。

表4COX-2rs20417G/C基因多态性分型与发病部位及病理参数的关系

Tab.4 Correlation of COX-2 rs20417 G/C SNP with lesion site and pathological parameters in colorectal cancer [n(%)]

表5COX-2rs2745557G/A基因多态性分型与发病部位及病理参数的关系

Tab.5 Correlation of COX-2 rs2745557 G/A SNP with lesion site and pathological parameters in colorectal cancer [n(%)]

3 讨 论

COX-2是催化花生四烯酸转化为前列腺素的关键限速酶, 在肿瘤发生、侵袭及转移过程中有显著调控作用。近年来，吴齐兵等[4]研究显示COX-2在包括CRC在内的一些肿瘤中存在过度表达现象，提示COX-2在CRC的发生发展中起着重要作用。本文采用PCR-RFLP技术对198例陕西省CRC患者与200例健康人进行病例-对照研究, 探讨COX-2基因多态性与CRC的易感性关系, 并分析其与CRC患者病理特点的相关性。

国内高婷花等[5]研究表明COX-2基因多态性与多种肿瘤易感性相关，且与CRC的易感性密切相关。国外大量研究发现，与基因型COX-2 rs20417 GG相比，基因型GC患结肠癌风险明显上升[6]。本研究结果显示陕西人群中COX-2启动子区rs20417位点的基因多态性与CRC的发病风险显著相关, C等位基因是CRC的风险因素，与国内外研究结果一致。

相关研究证实,与基因型COX-2 rs2745557 GG相比，基因GA/AA患CRC的风险显著增加，且A等位基因频率与CRC的淋巴结转移及分期显著相关[7]；本研究证实陕西人群COX-2 rs2745557 G/A位点的基因多态性与CRC的发病风险相关，A等位基因是CRC的危险因素，含有A等位基因的CRC患者淋巴结转移率较高，且与TNM肿瘤分期中Ⅲ～Ⅳ期密切相关，表明其可能参与了肿瘤的发生发展过程。

然而，一些国外研究发现COX-2 rs20417 G/C多态性与结肠癌易感性并无直接联系，表明COX-2基因多态性有种族差异，不同种族中基因型的频率不同[8]。此外，COX-2作为肿瘤发生的危险因素之一，在包括肺癌、食管癌及胃癌等都得到了证实[9]。

人类COX-2基因是由604个氨基酸残基编码组成的多肽，在启动子区有一些转录调控序列，这些转录调控序列及3′端非编码区与COX-2的表达调控密切相关。COX-2启动子含有多个转录因子的结合位点，COX-2 rs2745557的G/A突变为1个c-Myb转录因子结合位点，增强了COX-2的启动子活性，从而提高其转录活性而促进肿瘤形成。相关机制研究发现COX-2高表达可使金属蛋白酶-2活性增加，膜金属蛋白酶表达增多，有利于癌肿侵袭淋巴结而发生转移[10]。本研究也显示高表达基因型rs2745557(AG/AA)与CRC的淋巴结转移相关，可能与这一机制相关。

结肠癌和直肠癌的发病机制尚存在差异，但在此研究中我们没有发现COX-2基因多态性与发病部位存在显著性差异，提示COX-2的表达对于CRC的发生没有部位特异性，但仍需要进一步实验验证。此外，本研究对陕西人群COX-2基因启动子区多态性与CRC易感性进行了关联研究，由于条件的局限性，仍存在有一些不足的地方。本研究虽然纳入了CRC患者198例，但对进行分层分析来看样本量仍相对较少，可能会对研究的结果产生一定的偏倚。

总之，本研究结果表明陕西人群中COX-2 rs20417(G/C)位点多态性的C基因是CRC的危险因素，COX-2 rs2745557(G/A)的AG/AA基因型是CRC的风险因素，且与CRC的分期及淋巴结转移有显著相关性，两个基因位点与发病部位无相关。此研究有助于阐明CRC易感性的分子基础，为CRC的预防提供了理论依据。

参考文献：

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[4] 吴齐兵，孙国平. 探讨COX-2在结肠癌中表达的临床意义及预后[J]. 安徽医学, 2010, 31(7):730-732.

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[6] 姜玉梅. 环氧化酶COX-2-765G>C多态与结直肠癌易感性关系的meta分析[J]. 现代肿瘤医学, 2012, 20(12):2594-2598.

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