清益宁络方对IgA肾病小鼠系膜细胞及系膜基质的影响

夏欣欣，周冬枝，韩萍萍，曹丽君，袁 慧

(西安交通大学医学院第一附属医院中医科，陕西西安 710061)

IgA肾病(immunoglobulin A nephropathy, IgAN)是世界范围内最常见的肾小球疾病，我国IgAN占原发性肾小球肾炎的45.2%～58.2%[1]。IgA肾病的自然病程差异很大。最新研究首次报道了我国汉族成年IgAN患者的20年肾脏累计生存率67%，在确诊后20年内33%患者进入终末期肾病(ESRD)[2]。系膜细胞(mesangial cell, MC)增殖，系膜基质增生是IgA肾病的重要病理改变，增殖的MC分泌出一系列细胞因子及炎症介质，使损伤进一步扩大，系膜细胞增生后可分泌大量炎症因子并导致细胞外系膜基质(ECM)的积聚，最终引起肾小球硬化。肾小球硬化和肾小管纤维化可与临床血尿、蛋白尿、尿素氮、肌酐严重程度及临床表现不一致，临床表现轻但病理损伤重，是独立于临床的病理危险因素之一[3]。本课题组临床应用清益宁络方治疗IgAN血尿、蛋白尿取得很好疗效，故进一步研究其作用机制，了解该方对系膜细胞及ECM的影响和在IgA肾病肾纤维化进展中的作用。

1 材料与方法

1.1实验用药牛血清白蛋白(BSA)由上海源聚生物科技有限公司提供，葡萄球菌肠毒素B(SEB)由解放军军事医学科学院提供。

清益宁络方由生黄芪、女贞子、旱莲草、积雪草、黄蜀葵花、蒲黄、白茅根、当归、泽兰共9味中药组成，药物购自西安交通大学医学院第一附属医院中药房，按比例称取后加水浓煎至3 g/mL；雷公藤多甙片，10 mg/片，为上海美通生物科技有限公司产品。

1.2实验动物及模型制作选用健康雄性ICR小鼠60只，体质量18～20 g，6～7周龄，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。

IgA肾病模型制作参照刘志红等[4]报道的造模方法并进行改良，采用复合法建立，即在口服免疫的同时，结合腹腔注射和静脉注射。第1～6周，进行预免疫，除正常组外，其余各组小鼠隔日按200 mg/kg体重口服1 g/L BSA酸化水(6 mmol/L盐酸)，至12周末。第6周起定时腹腔注射BSA 0.2 mL/只，每日1次，连续3次。第8周起定期尾静脉注射SEB，以无菌生理盐水稀释，剂量为0.4 mg/kg，每周1次，连续3周。

1.3分组及给药方法适应性喂养1周，选取尿蛋白和尿红细胞均为阴性的小鼠58只作为观察对象，随机分组。正常组(n=10)按1.2方法隔日饮用蒸馏水，至处死日，但第6周及第8周起腹腔、尾静脉注射与造模等量、等次的蒸馏水。其余组按1.2方法造模后分为模型组(n=12)、雷公藤多甙组(n=12)及清益宁络方低剂量组(n=12)、清益宁络方高剂量组(n=12)。于实验第8周开始给药，每日1次，连续5周。清益宁络方高剂量组按每日36.4 g/kg(相当于人常用剂量的20倍)，低剂量组按每日18.20 g/kg(相当于人常用剂量的10倍)，雷公藤多甙组按每日5 mg/kg剂量分别灌胃，模型组及正常组分别灌服同等量的蒸馏水。在上述12周内，各组动物自由饮水进食。

1.4肾组织病理学观察第12周末，断脊处死小鼠，取右肾做石蜡包埋，包埋后切成4 μm的切片，分别进行苏木素伊红(HE)、过碘酸雪夫反应(PAS)染色，在光镜下观察肾小球的各种病理改变、系膜细胞增殖和系膜基质增生程度。

1.5系膜基质含量测定通过彩色病理图像分析系统对系膜基质含量进行灰度测定。

1.6评价标准肾小球系膜细胞计数方法[5]：采用3个正切肾小球的细胞数平均值作为细胞数，反映系膜细胞的增生程度。

肾小球系膜增生标准[6]：Ⅰ度(轻度)为系膜轻度增生，毛细血管未受压或仅轻度受压；Ⅲ度(重度)为系膜重度增生，以系膜基质为主，毛细血管重度受压；Ⅱ度(中度)为系膜增生程度介于轻重度之间。

ECM含量测定[7]：PAS阳性物质含量代表系膜基质，用PAS灰度值表示。图像分析中，平均灰度用来表示图像的透光率(分为256级，最黑为0级，最高为256级)。PAS阳性物质平均灰度值越高，说明其免疫组化染色越浅，肾组织内该物质含量越低，即PAS灰度值与PAS阳性物含量成反比。采用图像采集与分析系统，在200倍光镜下测量每个肾小球的面积和阳性物质灰度值，相除得出其单位面积的平均灰度。每组小鼠选取6只标本，每个标本测量5个大小相近的肾小球进行测量，取其平均值作为该标本的结果。

2 结 果

2.1各组小鼠生存情况前6周各组小鼠状态良好，6周起腹腔注射10 g/L BSA缓冲液及尾静脉注射SEB后，模型组及雷公藤多甙组、清益宁络方高剂量组、清益宁络方低剂量组小鼠均有不同程度的摄食减少，精神萎靡，活动度减少，部分小鼠毛色无光泽，蓬松发黄，出现腹泻，多于1周左右自行缓解，模型组表现较其他组严重。实验过程中，部分小鼠死亡(死亡原因与过敏反应、进食少、腹泻及感染等有关)，从实验中剔除，最终存活小鼠数为正常组10只，模型组8只，雷公藤多甙组9只，清益宁络方高剂量组9只，清益宁络方低剂量组8只。实验结束时正常组小鼠活泼好动，毛色光泽，状态较好。

2.2光镜下的病理观察结果正常组无系膜细胞增殖及ECM增多；模型组系膜细胞明显增殖，ECM增多，中重度增生为主，间质炎性细胞浸润，未发现球囊黏连及肾小球硬化；雷公藤多甙组、清益宁络方高剂量组、清益宁络方低剂量组系膜细胞增殖减轻，ECM轻度增多，轻中度增生为主，以清益宁络方高剂量组减轻明显(图1)。

图1各组小鼠肾组织的PAS染色

Fig.1 PAS staining of mouse kidney tissue in all the groups (×200)

A：正常组；B、C：模型组；D：雷公藤多甙组；E：清益宁络方低剂量组；F：清益宁络方高剂量组。

2.3各组ECM增生程度比较系膜基质增生程度与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.004 5)；清益宁络方高、低剂量组ECM增生程度组间比较及与雷公藤多甙组比较差异均无统计学意义(P>0.004 5，表1)。

表1各组小鼠系膜增生程度比较(秩和检验)

Tab.1 Comparison of mesenterium hyperblastosis in all the groups (Kruskal-Wallis H)

组别例数系膜基质增生(例)正常Ⅰ度Ⅱ度Ⅲ度正常组1010000模型组*80026雷公藤多甙组#90171清益宁络方 高剂量组#91530 低剂量组#80251

总组间P<0.01。多组间两两比较：与正常组比较，*P=0.000 3<0.004 5，与模型组比较，雷公藤多甙组#P=0.003 1<0.004 5，清益宁络方高剂量组#P=0.002 4<0.004 5，清益宁络方低剂量组#P=0.003 0<0.004 5。

2.4各组ECM的PAS灰度值比较模型组灰度值低于正常组及各药物治疗组，即模型组系膜基质含量高于正常组及各药物治疗组，比较差异有统计学意义(P<0.01)；而清益宁络方高剂量组灰度值明显高于雷公藤多甙组，即系膜基质含量低于雷公藤多甙组(P<0.05)，清益宁络方低剂量组与雷公藤多甙组比较及高低剂量组间比较差异无统计学意义(P>0.05，表2)。

表2各组小鼠系膜基质PAS灰度值比较

Tab.2 Comparison of mesangial matrix gray scale of PAS staining in all the groups

与正常组比较，*P=0.000 65<0.01；与模型组比较，雷公藤多甙组#P=0.000 92<0.01，清益宁络方高剂量组#P=0.002 2<0.01，清益宁络方低剂量组#P=0.005 1<0.01；与雷公藤多甙组比较，清益宁络方高剂量组▲P=0.017 8<0.05。

2.5各组系膜细胞增殖结果各用药组系膜细胞增殖与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；与雷公藤多甙组比较，清益宁络方高剂量组系膜细胞数减少，差异有统计学意义(P<0.05)，而清益宁络方低剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。清益宁络方高、低剂量组间比较差异无统计学意义(P>0.05，表3)。

表3各组小鼠系膜细胞数比较

Tab.3 Comparison of mouse mesangial cells count in all the groups

组 别例数系膜细胞数(个)正常组1030.20±1.67模型组848.58±3.69*雷公藤多甙组937.19±3.52#清益宁络方高剂量组933.15±2.26#▲清益宁络方低剂量组836.74±3.60#

与正常组比较，*P=0.000 21<0.01；与模型组比较，雷公藤多甙组#P=0.003 7<0.01，清益宁络方高组剂量组#P=0.000 09<0.01，清益宁络方低剂量低组#P=0.001 3<0.01；与雷公藤多甙组比较，清益宁络方高剂量组▲P=0.041 2<0.05。

3 讨 论

ECM积聚、肾小球硬化和肾小管间质纤维化是慢性肾脏疾病进展的共同通路，IgA肾病也不例外。终末期肾病无特殊有效治疗手段，但对早中期肾病进行干预，防止其进入肾功能衰竭期，对临床具有重要意义。

ECM在肾脏的大量沉积是肾脏纤维化的重要病理基础。其发生机制十分复杂，但总体是肾小球内ECM合成过程增强和降解过程受到抑制的结果。已证明肾小球血液流动学改变能促进系膜细胞合成ECM；活化的系膜细胞能产生更多的ECM成分；血管紧张素Ⅱ及内皮素1等血管活性物质和TGF-β等细胞因子的过度表达与分泌，均能引起ECM成分合成增多而导致ECM积聚。在肾小球损伤过程中，在细胞因子作用下，降解ECM的酶纤溶酶原激活物(PA)和基质金属蛋白酶(MMPs)的活性受到抑制，而纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)和金属蛋白酶组织抑制物(TIMPS)活性增强，呈高表达并逐渐占主导地位，使降解失平衡，引起ECM降解减少而发生积聚，最终发展至肾脏纤维化及肾小球硬化[8]。

肾小球系膜是位于肾小球毛细血管小叶的中央部分，由系膜细胞和ECM组成。系膜细胞可产生多种细胞因子，通过自分泌或旁分泌方式参与肾小球炎症反应；系膜细胞可产生多种ECM，参与肾小球基膜的修复和更新，在病理情况下造成肾小球硬化；系膜细胞上有Fc受体和C3b受体，可参与免疫反应[9]。系膜细胞在炎症过程中不仅是被动受害者，其通过结构和功能的改变直接影响炎症的进程。若系膜持久遭受损伤，炎症过程会变成慢性，系膜细胞持续激活。因而，在IgA肾病早期，通过药物治疗的途径对系膜细胞和ECM进行干预，减轻肾组织病理改变，是防止纤维化的有效措施。

本研究采用HE染色观察肾组织的基本病理改变，通过PAS染色观察系膜细胞数量和ECM并根据ECM增生程度进行病理分级。结果发现模型组ECM中重度增生，系膜细胞增殖明显；清益宁络方组及雷公藤多甙组ECM轻中度增生，系膜细胞增殖较之模型组明显减少，其中清益宁络方高剂量组病理改变轻于雷公藤多甙组，说明该方能够抑制系膜细胞增殖及ECM增生，其作用优于雷公藤多甙。

由于PAS染色在肾脏病理学中常用来观察ECM，PAS阳性物质含量代表ECM，对阳性物质灰度值进行检测来客观评定肾脏细胞外基质的变化。通过彩色病理图像分析系统，对PAS灰度(ECM含量)的检测表明，模型组肾组织内ECM含量最高，清益宁络方高剂量组较之雷公藤组有所减少，高低组间ECM含量变化无显著差异。说明该方能减少肾组织ECM含量，抑制细胞外基质的过度沉积，其作用强于雷公藤多甙。

中国古代医籍中没有IgA肾病的病名或病症，但根据其发展过程中的临床表现及发病特点，归属于“水肿”“腰痛”“尿血”等中医病症范畴。本病乃本虚标实之证，气阴两虚为本，风热、湿热为标，瘀血贯穿始终。在肾脏病理与中医证侯分型的相关性研究中发现，IgA肾病等以系膜增生为主的肾小球肾炎与气阴两虚证、阴虚证、气虚证相关，其中气阴两虚证最多[10]。湿热伤肾是肾炎病理的基本特点，且往往贯穿病程的始终。对于IgA肾病，从反复感染致病、局部炎症浸润、免疫复合物沉积、细胞因子等作用致系膜细胞增生和ECM增多，最后导致肾纤维化的过程看，可以认为是在气阴两虚基础上，湿热致瘀，湿瘀交阻的病理结果。

清益宁络方立足于IgA肾病的病因病机，以“清”和“补”为原则组方，由生黄芪、女贞子、旱莲草、积雪草、黄蜀葵花、蒲黄、白茅根、当归、泽兰共9味中药组成，具有健脾补肾，活血化瘀，利湿降浊之功效。方中黄芪益气固表、利水消肿为君药；女贞子、旱莲草能滋补肝肾之阴，并除虚热；白茅根清热凉血而不留瘀，起到标本兼治的作用，共为臣药；黄蜀葵花、积雪草清利湿热，当归能活血化瘀，蒲黄、泽兰既收敛止血，又行血祛瘀，止血效果较佳，共为佐使。方中各药配合，补而不滞邪，通而不伤正，止血不留瘀，周到而主次有序，既扶正又祛邪。临床研究证实该方对血尿蛋白尿有良好疗效，本实验进一步证实该方具有抑制系膜细胞增殖及ECM沉积，减轻肾组织病理损害的良好作用，能延缓IgA肾病肾纤维化进程，为临床IgA肾病治疗提供有效方药。

参考文献：

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