版纳微型猪近交系TDRP1基因克隆、鉴定及mRNA的组织表达特性

王配，霍金龙，王淑燕，潘伟荣，查星琴，施晨，曾养志

(1.云南农业大学 云南省版纳微型猪近交系重点实验室，昆明 650201；

2.云南农业大学 动物科学技术学院，昆明 650201)

版纳微型猪近交系(BMI)从1980年建系以来，一直采用全同胞和亲子交配的高度近交加严格选择的方法进行培育，克服了早期世代中存在的严重近交衰退，于2003年进入20世代，达到了国际和国内实验动物委员会对近交系培育的标准，成为世界上第一个培育成功的大型哺乳动物近交系。2005年通过了由遗传学、实验动物学、医学、动物育种学等专家组成的鉴定委员会的成果鉴定。其解剖、发育、生理、病理、疾病发生等方面与人类极为相似，是生物医学领域研究的理想实验动物模型[1-4]。版纳微型猪近交系自建系以来有多个亚系断代，通过大量观察、统计以及基础研究发现，繁殖力较差的亚系其公猪精液品质相对较差、畸形率较高。据报道雄性动物不育多由生精障碍造成[5]，而精子发生又是一个复杂的细胞分化过程，受生殖细胞的基因组控制[6-7]，有许多的基因参与调控，这些基因构成了一个有机的空间网络，每个基因都在其中发挥着特定的功能[8-9]。挖掘、寻找、鉴定生精障碍相关基因，了解雄性不育的遗传病因，阐明发病机制是解决版纳微型猪近交系繁殖障碍的有效途径。

睾丸发育相关蛋白(testis development-related protein, TDRP)是一种新型核因子，于2010年首次从人睾丸cDNA文库中克隆获得[10]，最初称为染色体8开放阅读框42(chromosome 8 open reading frame 42, C8orf42)。TDRP有2个完全不同的转录子，转录子1(TDRP1)含有3个外显子，ORF长549 bp，编码183个氨基酸；转录子2(TDRP2)含有4个外显子，ORF长594 bp，编码198个氨基酸[10]。人和鼠的Northern blot、免疫组化和组织Western blot研究结果表明TDRP1 mRNA和蛋白质都主要在成年个体睾丸组织的生精细胞中表达，尤其在精母细胞中表达量最高，并且其表达还受发育调控，随着发育成熟，TDRP1的表达量逐渐升高；且TDRP1在生精功能障碍所致的男性不育患者睾丸组织中的表达明显低于生精功能正常的睾丸组织，说明TDRP1在维持哺乳动物精子正常功能方面具有重要作用[10]。目前关于TDRP1基因的研究相对较少，在NCBI Pubmed数据库中，只能搜索到几篇文献，有必要深入研究；另外鉴于其在人类和啮齿类动物精子发生方面取得的进展，认为其可能与BMI公猪的繁殖力有一定的相关性，故本研究应用RT-PCR方法从不育和可育BMI公猪睾丸组织中克隆TDRP1基因，分析其序列特征、检测其mRNA表达特性并预测其蛋白质功能，为下一步以BMI为动物模型研究TDRP1的功能和阐明BMI公猪生精障碍机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物

以成年(15月龄)的BMI不育公猪为实验材料，并以成年(15月龄)的BMI可育公猪为对照，活体去势采集睾丸，液氮速冻，-80℃超低温冰箱保存以备RNA提取，用于克隆目的基因和分析其与BMI公猪繁殖力的关系。

选取正常的BMI可育公猪(12月龄)1头。屠宰后采集心、肝、脾、肺、肾、胸腺、淋巴结、皮肤、十二指肠、胃、大脑、小脑、睾丸、附睾、精囊腺、前列腺和尿道球腺等17种组织，提取RNA,用于目的基因多组织表达谱研究。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和cDNA合成

利用TaKaRa公司的RNAiso Plus分别提取各种组织的总RNA，参考Invitrogen公司的逆转录酶M-MLV试剂盒操作说明将组织总RNA反转录成cDNA，具体步骤可参照说明书和文献[11]进行。

1.2.2 设计、合成PCR引物

利用NCBI已公布的猪的TDRP1基因(登录号：NM_001198925)序列，综合应用Primer Premier 5.0和Oligo 6软件设计特异性引物(见表1)，由上海生工生物工程有限公司合成，进行BMITDRP1基因的编码区序列扩增。以持家基因GAPDH或18S为内参，根据文献引物扩增[12-13]，用于分析目的基因的相对表达量。

表1 TDRP1和内参基因的PCR引物信息和扩增程序

1.2.3 PCR扩增

利用TakaRa的ExTaq酶进行扩增，模板为睾丸组织RNA反转录的cDNA，PCR反应体系为：12.5 μL 2×GC buffer I，2 μL的稀释后的25 ng/μL的cDNA，10 μmol/L 的正、反向引物各0.5 μL，0.25 μL的5 U/μL的ExTaq酶，加水补足至25 μL。扩增程序见表1。PCR产物利用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪照相，产物送上海美吉生物医药科技有限公司测序。

1.2.4 TDRP1蛋白生物信息学分析

根据所获得的BMITDRP1基因cDNA全序列预测其氨基酸序列，参考Qin等[14]描述的方法进行TDRP1蛋白分子量(Mw)、等电点(pI)、信号肽、亚细胞定位和二级结构的预测。蛋白磷酸化位点使用NetPhos2.0程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)在线预测，亮氨酸富集的核输出信号使用NetNES1.1程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNES/)在线预测。

在Swiss-Prot中搜索得到人、恒河猴、大鼠和小鼠的TDRP1的氨基酸序列(NP_778250、NP_001252913、NP_001094261和NP_776105)与BMI的TDRP1的氨基酸序列进行同源性和序列比对分析，并进行系统进化分析，其中同源性分析采用DNASTAR软件中的MegAlign程序，序列比对分析采用ClustalX 1.83和DNAMAN软件进行，分子系统进化树利用MEGA5.2软件构建。

1.2.5TDRP1表达分析

用TDRP1 F/R引物检测不育和可育公猪睾丸的基因表达水平和多组织表达谱，其中GAPDH作为不育和可育公猪睾丸组织表达水平检测的内参，18S作为多组织表达谱的内参。PCR扩增参照1.2.3，在检测TDRP1基因的多组织表达谱时，PCR为32个循环，18S为30个循环。而在分析TDRP1在不育和可育公猪睾丸组织的差异性表达时，进行了循环数优化，最终GAPDH和TDRP1的PCR扩增循环数分别为28和30。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后利用Quantity One软件测定每个条带灰度值，以18S或GAPDH为参照，进行比较获得相对表达水平。

2 结果与分析

2.1 TDRP1基因在不育和可育公猪睾丸中表达水平分析

从活体去势采集到的BMI不育和可育公猪睾丸组织中提取总RNA，经反转录反应后，以cDNA为模板，以TDRP1 F/R为引物扩增得到了680 bp的条带，与预计大小相符，见图1。TDRP1的表达量用GAPDH的表达量校正后获得相对表达水平。结果，以GAPDH基因为内参，TDRP1基因在不育公猪和可育公猪个体的睾丸组织中mRNA表达水平接近，差异无显著性(P>0.05)。

2.2 TDRP1 cDNA序列及蛋白质理化性质预测结果

通过PCR产物原液测序，得到了一条680 bp的核苷酸序列，发现TDRP1基因序列在BMI不育和可育公猪个体间完全一致，无变异位点；但与参考序列NM_001198925相比，在编码区有两处同义突变，分别为c.33(C> G)和c.348(C > T)，见图2。此序列已提交GenBank，基因登录号为KJ186786，其中包含了561 bp的开放阅读框、87 bp 5′非编码区和32 bp 3′非编码区，编码186个氨基酸，如图2所示。BMI TDRP1蛋白质分子质量为20.49 ×103，等电点为5.86，无信号肽，存在1个亮氨酸富集的核输出信号(75AA-81AA)(图2和3)，亚细胞定位预测显示该蛋白位于细胞核的概率是94.1%。

注：M.DL2000分子量标准；1.不育公猪；2.可育公猪。

注：ATG.起始密码子；*.终止密码子；上一行大写字母为核酸序列，对应的下一行为氨基酸序列；小写字母为5′和3′侧翼序列；方框为引物序列；双下划线为亮氨酸富集的核输出信号；▲为突变碱基(相对参考序列：NM_001198925)。

2.3 TDRP1蛋白质二级结构预测结果

通过SOPMA程序预测的BMI TDRP1蛋白二级结构中含17 AA的延伸链结构(9.14%)，30 AA的β-转角(6.13%)，44 AA的α-螺旋(23.66%)，95 AA的无规则卷曲(51.08%)(图4)。

2.4 TDRP1蛋白质同源性分析

用猪的TDRP1氨基酸序列在Swiss-Prot中进行同源性搜索，获得了人、恒河猴、小鼠和大鼠等动物的TDRP1氨基酸序列，序列比对分析表明，猪TDRP1与人TDRP1的相似性为82.7%，与恒河猴的TDRP1相似性为83.2%，与小鼠的TDRP1相似性为74.0%，与大鼠的TDRP1相似性为73.5%(表2)。哺乳动物TDRP1氨基端和羧基末端均相对保守，中间某些区域变化较大(序列比对见图5)。

2.5 TDRP1分子系统进化树

利用MEGA5.2构建了BMI猪、人、恒河猴、小鼠和大鼠TDRP1氨基酸的系统进化树(见图6)，小鼠和大鼠聚为一支，人和恒河猴聚为一支，猪为另一支，但猪与灵长类比与啮齿类更近。

2.6 TDRP1蛋白质磷酸化位点预测结果

通过NetPhos2.0软件在线预测发现TDRP1包含一些保守的蛋白质磷酸化位点，包括14个丝氨酸磷酸位点，1个苏氨酸磷酸位点和1个酪氨酸磷酸化位点，见图7。结合不同物种的氨基酸比对结果，发现8个丝氨酸(67、70、87、144、149、156、160、169和174位)和1个酪氨酸(147位)磷酸化位点高度保守，见图5和图7。

2.7 TDRP1多组织表达谱分析结果

以看家基因18S为内参，利用RT-PCR方法检测TDRP1基因在版纳微型猪近交系正常公猪17个组织(包括心、肝、脾、肺、肾、胸腺、淋巴结、皮肤、十二指肠、胃、大脑、小脑、睾丸、附睾、精囊腺、前列腺和尿道球腺)的转录水平，多组织表达谱分析表明BMITDRP1基因在各组织中存在明显的差异表达现象(图8)，在精囊腺和前列腺中高表达，在睾丸和小脑中中度表达，在大脑和肾脏中低表达，在其余11种组织中不表达。

图3 NetNES1.1程序预测的TDRP1蛋白亮氨酸富集的核输出信号

注：分别用最长、次长、第三长和最短的垂直线表示α-螺旋、延伸链结构、β-转角和无规则卷曲。

表2 BMI和其他4个物种TDRP1氨基酸序列的同源性分析

注：保守的丝氨酸磷酸位点用空五角形标记(☆)，保守的酪氨酸磷酸位点用实五角形标记(★)。

图6 BMI猪、人、恒河猴、小鼠和大鼠的TDRP1氨基酸序列构建的分子系统进化树

图7 NetPhos2.0程序预测的猪TDRP1蛋白磷酸化位点

注：M.DL2000 分子量标准，1.心，2.肝，3.脾，4.肺，5.肾，6.胸腺，7.淋巴结，8.皮肤，9.十二指肠，10.胃，11.大脑，12.小脑，13.睾丸，14.附睾，15.精囊腺，16.前列腺，17.尿道球腺。

3 讨论

本研究以TDRP1为公猪繁殖性状的候选基因，分析其在BMI不育和可育公猪中的序列和mRNA表达水平的差异性，并进一步研究了该基因在近交系公猪重要组织中的表达规律。通过分析发现，BMI不育和可育公猪TDRP1基因编码序列完全一致，但和参考序列NM_001198925相比，在编码区有2处同义突变，是一种新的单倍型，已提交GenBank，基因登录号为KJ186786，对应的蛋白质登录号为AHV91001。由于发现的SNP位点在不育公猪和可育公猪中都存在；另外，TDRP1基因在不同个体的睾丸组织中mRNA表达水平接近，差异无显著性；故认为TDRP1基因点突变与BMI不育公猪的低繁殖力关系不大。

以18S为内参校正的多组织表达谱说明BMITDRP1基因在各组织中存在明显的差异表达现象，在精囊腺和前列腺中高表达，在睾丸和小脑中中度表达，在大脑和肾脏中低表达，在其余11种组织中不表达，这与TDRP1在约克夏和香猪中研究结果不太一致[15-16]，但由于在约克夏和香猪没有进行精囊腺和前列腺TDRP1 mRNA表达水平的检测，所以不能确定是物种还是试验技术原因造成的差异，需要进一步的研究确认。人和小鼠的研究认为TDRP1发挥功能的主要部位是睾丸[10]，故关于TDRP1基因在BMI精囊腺和前列腺高表达的生物学意义尚不清楚。

生物信息学分析显示BMI TDRP1蛋白无信号肽，说明它属于非分泌性蛋白，是在游离的核糖体上合成的，会直接释放到细胞质基质中，不需经过内质网-高尔基体分泌途径的修饰，只用于构成细胞的自身结构。预测BMI TDRP1存在1个亮氨酸富集的核输出信号(NES)，而人和猪的TDRP1蛋白同样也有1个亮氨酸富集的核输出信号(NES)[10,17]，该信号的主要功能在于蛋白亚细胞定位，与精子生成相关；亚细胞定位预测显示该蛋白位于细胞核的概率是94.1%，两者结果基本一致。BMI TDRP1氨基酸与人、恒河猴、小鼠和大鼠的氨基酸序列比对分析表明相似性高于73%，在不同物种间存在较高的同源性。从包括BMI在内的5个物种TDRP1构建的分子系统进化树看，小鼠和大鼠是啮齿目，聚为一类；人和恒河猴均为灵长目，聚为一类；猪相对于啮齿目，与灵长目更为接近，与其聚为一大类。获得的5个物种TDRP1蛋白质序列系统进化树与其分类学地位一致。蛋白质磷酸化是调节和控制蛋白质活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的机制[18]，预测发现了BMI TDRP1存在16个保守的蛋白质磷酸化位点，其中有8个丝氨酸和1个酪氨酸磷酸化位点在哺乳动物中高度保守，这些氨基酸基序可能在TDRP1蛋白参与精子发生过程中发挥重要的作用。

综上所述，本研究克隆了BMITDRP1基因的cDNA序列，并对其进行了一些必要的功能预测，研究了其在不育和可育公猪间序列和mRNA表达水平的差异性，并进行了多组织表达谱分析。揭示了精囊腺和前列腺是TDRP1基因mRNA表达最高的部位，且发现了2处BMI特有的SNP位点，是一种新的单倍型。研究结果为深入研究TDRP1基因的功能奠定了基础。

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