MicroRNA-134/CREB/pCREB通路在癫痫中的表达及意义

王倩, 陈阳美,郭靖,杨小兰，谢运兰

(1.重庆医科大学附属第二医院神经内科，重庆 400010;

2.资阳市乐至县人民医院神经内科，四川 资阳 641500；

3.重庆医科大学附属第二医院中心实验室，重庆 400010)

癫痫(epilepsy)是一种由不同病因引起的以脑部神经元高度同步异常放电所致的短暂性脑功能失常为特征的慢性脑部疾病[1]。癫痫反复发作可导致神经元的坏死和凋亡、特异性突触重塑、胶质增生及苔藓纤维出芽等，其中特异性突触重塑及苔藓纤维出芽可促进异常兴奋性环路的形成，进而发展成为难治性癫痫[2-7]。大量癫痫病理生理研究研究表明，异常的轴突、树突的生长发育形成了异常的突触，这可能是导致异常的兴奋性神经环路形成的原因之一，从而促使了癫痫的发生与发展。树突棘位于突触后成分中，其形成和降解的动态变化被认为是突触可塑性的标志[8,9]。Schratt等[10]研究结果显示microRNA-134(miR-134)可调控树突棘的形态。CREB是神经元可塑性重要的调节因子，其磷酸化活性形式对树突生长和树突精细结构的调节起重要作用[11-14]。而miR-134 通过转录后机制调节CREB蛋白的表达，miR-134过表达可抑制CREB的翻译负性调节突触可塑性；反之则增加突触的可塑性[15]。本研究通过观察难治性癫痫组与非难治性癫痫组颞叶组织、正常对照与癫痫模型大鼠海马组织miR-134、CREB、pCREB的表达变化，探讨miR-134/CREB/pCREB信号通路在癫痫发生发展过程中的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

42只清洁级成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠来自重庆医科大学实验动物中心【SCXK(渝)2012-0002】，体重(200±20) g，6～8周龄，饲养于环境温度22～26℃，湿度50%～60%，12 h昼夜循环，自由进食及饮水的标准环境中【SYXK(渝)2010-0002】，所有试验过程遵照重庆医科大学动物伦理委员会的规定。将实验动物按随机数字表法分为对照组及癫痫点燃后1、3、7、14、30、60 d组，每组6只。

1.2 氯化锂—匹罗卡品癫痫模型

癫痫组大鼠腹腔注射氯化锂127 mg/kg，16～20 h后注射匹罗卡品35 mg/kg(Sigma公司)，在注射匹罗卡品30 min前注射阿托品1 mg/kg，发作严重程度按照Racine分级[16]方法(0级：无任何反应；Ⅰ级：面部阵挛，包括眨眼、动须、节奏性咀嚼等； Ⅱ级：Ⅰ级加节律性点头：Ⅲ级：Ⅱ级加前肢阵挛；Ⅳ级：Ⅲ级加后肢站立；Ⅴ级：Ⅳ级加摔倒)，实验动物连续3次达到IV-V级发作即被认为达到癫痫持续状态(status epilepticus, SE), SE点燃后45 min腹腔给予地西泮10 mg/kg终止发作，未达到标准的大鼠反复给予匹罗卡品10 mg/kg，每15 min一次，直至出现SE为止，每只大鼠总量不超过50 mg/kg。对照组大鼠腹腔注射生理盐水代替匹罗卡品，其余处理同癫痫组。

1.3 人颞叶组织标本

(1)实验中所涉及的14例难治性癫痫患者颞叶病灶标本来自第三军医大学新桥医院。进行外科手术的颞叶癫痫患者其临床表现均达到难治性癫痫的诊断标准：正规使用3种及以上的AES药物，血药浓度处于维持水平，使用2年仍不能控制癫痫发作；每月痫性发作4次以上；排除其他中枢神经系统疾病。病灶病理改变主要为：神经元缺失、变性、胶质细胞增生，取材部位为颞叶皮质；患者平均年龄：(20.38±10.22)岁。

(2)10例非癫痫对照组标本来源于第三军医大学新桥医院神经外科，患者为颅脑损伤，颅内高压，需外科开颅减压者。纳入标准为：诊断脑外伤明确，其他非癫痫颅脑疾病引起的颅内高压，需手术治疗，术后病理检查脑组织结构正常；无癫痫病史和家族史；取材部位为颞叶皮质。患者平均年龄：(36.80±13.01)岁。

1.4 试剂

匹鲁卡品(Sigma公司,美国)，RNA提取、SYBR Premix Ex TaqTMII、RNAiso Plus、PrimeScript RT reagent Ki试剂盒(TaKaRa公司，中国大连)，U6 及 miR-134 特异性反转录及 PCR 引物(南京金斯瑞，中国南京)，全蛋白提取试剂盒(凯基公司，中国南京)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)(碧云天公司，中国上海)，CREB、pCREB多克隆一抗(Cell Signaling Technology，美国)，NPY(武汉三鹰公司，武汉)。

1.5 组织处理

(1)将术中获得的人脑颞叶皮质标本分成两部分：一份保存于液氮中作为RT-PCR及Western blot的实验材料；一份放入4%多聚甲醛中保存24h后石蜡包埋组织，并将组织切成5μm厚度，作为免疫组化实验材料。

(2)造模成功后每组3只大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛1mL/kg后断头取脑，分离出两侧海马,立即浸入液氮中分别用于RT-PCR及Western blot检测。其余大鼠用4%多聚甲醛灌注固定后分离大脑，用石蜡包埋后冠状位切片，厚5 μm，用于免疫组织化学分析。

1.6 实时荧光定量PCR检测

取液氮保存的人颞叶皮质标本及大鼠海马组织提取总 mRNA。采用 RNAiso plus试剂(TaKaRa 公司)，按操作说明书提取。提取的总 RNA样本在加入RNase-free水完全溶解 RNA沉淀后-80 ℃中保存。RNA的浓度和纯度用 260 / 280 nm下检测，260 / 280 nm在1.9～ 2.20之间。反转录实验采用 TaKaR的反转录试剂盒，步骤为① 37 ℃ 60 min；② 85℃ 5 s。反应在 96孔 PCR板中进行，每个反应做3个复孔。PCR反应体系为 20 μL，RT 1μL，上下游引物各0.5 μL，SYRB Green荧光染料(TaKaRa 公司)10 μL，去离子水8 μL。反应条件为① 95 ℃，30 s； ② 95 ℃，5 s,60℃，20 s，40个循环。miR-134和β-actin的标准曲线保证扩增的效率在90%～110%之间。扩增和溶解曲线及数据用Bio-Rad CFX Manager软件分析。实时定量PCR双向引物序列：miR-134：5′-GGGGTGTGACTGGTTGAC-3′(南京金斯瑞，中国)，U6：F：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′：R：5′-CGCTICACGAATITGCGTGTCAT-3′。结果用平均2-ΔΔCT法进行分析。

1.7 Western blot检测

人颞叶皮质组织、海马组织提取全蛋白，根据全蛋白提取试剂盒说明提取，BCA法检测蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白：转膜采用全湿法，按照 3 张滤纸、PVDF 膜、完成电泳的胶、3 张滤纸的顺序依次排放，250 mA电流电转1 h；5%脱脂奶粉37℃封闭1 h；分别加入PBS稀释过的marker蛋白(β-actin，1∶1000)、兔多克隆CREB一抗(1∶100)及兔多克隆pCREB一抗(1∶50)，4℃冰箱过夜；TBST摇洗10 min×4次；加入TBST稀释的HRP标记的山羊抗兔二抗(1∶4000)，与膜37℃孵育1 h；再次TBST摇洗10 min×4次；ECL显色。应用Quantity One 图像分析软件，计算 PVDF 膜上条带的光密度值。用目的条带的光密度值比相应内参 β-actin 条带的光密度值得到该蛋白在组织中的表达量。

1.8 免疫组织化学检测

将组织切片在二甲苯中脱蜡，梯度酒精中脱水。自来水冲洗5 min，PBS磷酸盐缓冲液中浸泡3 min后于3%H2O237℃反应10 min，以灭活内源性过氧化物酶，PBS缓冲液冲洗3 min×3次，用枸橼酸抗原修复，煮沸3 min，92～98℃15 min，室温自然冷却后PBS缓冲液冲洗5 min×3次，滴加正常山羊封闭血清，37℃ 30 min；甩去多余血清加入稀释后的兔多克隆CREB一抗(1∶400)，兔多克隆pCREB一抗(1∶100)，阴性对照组用PBS代替一抗，4℃冰箱中过夜，第二日37℃孵育60 min复温，PBS缓冲液冲洗5min×3次，滴加生物素标记羊抗兔二抗工作液(中杉金桥)，37℃ 30 min，PBS冲洗5 min×3次，辣根酶标记链酶卵白素工作液(中杉金桥)37℃30 min，PBS冲洗5 min×3次，DAB显色，经苏木素复染，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。采用奥林巴斯BX51自动图片采集系统采集图片。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 实时荧光定量PCR测定miR-134

在大鼠癫痫点燃后72h(0.026±0.014)、7 d(0.021±0.007)、14 d(0.008±0.005)、60 d(0.015±0.004)miR-134的表达水平相对于正常对照组(0.034±0.017)表达明显降低(P<0.05)，14 d达到最低，而在1 d(0.031±0.018)、30d(0.030±0.012)时间点无明显差异(P>0.05)；在难治性癫痫患者颞叶皮质中miR-134的表达(0.062±0.039)较对照组(0.137±0.086)明显降低(P<0.05)，差异具有统计学意义。见图1。

注：癫痫模型组(a),临床标本(b)比较， P<0.05。

2.2 Western blot检测结果

2.2.1 CREB在人颞叶皮质及癫痫大鼠脑组织中的表达

CREB在人颞叶皮质及大鼠海马中均有表达，在癫痫大鼠点燃成功后1 d(0.214±0.088)及30 d(0.273±0.117)表达较对照组(0.225±0.04)无明显变化(P>0.05)，在3 d(0.423±0.123)、7 d(0.416±0.079)、14 d(0.44±0.054)、60 d(0.382±0.052)较对照组明显增加(P<0.05)；人颞叶皮质中难治性癫痫组CREB表达(0.335±0.177)较非难治性癫痫对照组表达(0.180±0.068)增加(P<0.05)，差异具有显著性。见图2。

注：癫痫模型(a；b)临床样本(c；d)比较， P<0.05。

2.2.2 pCREB在人颞叶皮质及癫痫大鼠脑组织中的表达

pCREB在人颞叶皮质及大鼠海马中均有表达，在癫痫大鼠点燃成功后1 d(0.386±0.055)、3 d(0.425±0.082)、7 d(0.379±0.074)、14 d(0.517±0.126)、30 d(0.492±0.037)、60 d(0.441±0.075)表达较对照组(0.174±0.045)均明显增加(P<0.05)；人颞叶皮质中难治性癫痫组pCREB表达(0.43±0.18)较非难治性癫痫对照组表达(0.27±0.115)增加(P<0.05)，差异有显著性。见图3。

注：癫痫模型(a；b)临床样本(c；d)比较， P<0.05。

2.3 免疫组化结果

2.3.1 CREB在癫痫大鼠脑组织中的表达

癫痫大鼠脑组织的海马区CREB阳性表达主要见于齿状回、CA1及CA3区神经元胞核。癫痫模型组72h时间点CREB表达明显多于正常对照组见图4(彩插3)。人颞叶皮质中CREB阳性表达主要存在于神经元细胞核中，且癫痫组明显多于对照组见图5(彩插3)。

2.3.2 pCREB在癫痫大鼠脑组织中的表达

癫痫大鼠脑组织的海马区pCREB阳性细胞主要见于齿状回、CA1及CA3区神经元胞核。癫痫模型组72h时间点CREB表达明显强于正常对照组见图6(彩插2)。 人颞叶皮质中pCREB阳性表达主要存在于神经元细胞核中，且癫痫组明显多于对照组见图7(彩插2)。

3 讨论

颞叶癫痫是一种常见的慢性神经系统疾病，其特征为复发性癫痫[1-3]。大量病理研究分析表明，苔藓纤维出芽(mossy fiber sprouting, MFS)和特异性突触重组是造成难治性癫痫的主要病理基础，其中MFS是突触重组的主要形式，广泛存在于难治性癫痫患者标本和癫痫动物模型中[17,18]。氯化锂-匹罗卡品大鼠是理想的颞叶癫痫模型，急性期表现为癫痫持续状态，随后有大约两周的潜伏期是异常兴奋性环路形成的关键时期并伴随动物一生，慢性期主要表现为自发性反复发作[28]，这与人类难治性癫痫的发生发展机制较为相似。众多研究显示[19,20]，microRNA(miR) 是一类长20bp左右具有高度保守性的，内源性非编码小RNA，其作为广泛存在与哺乳动物中枢神经系统中的基因表达调控因子，在神经系统发育、神经细胞分化、树突生长和突触重组中起重要作用。它主要通过核酸特异性序列的互补结合，在蛋白质翻译水平降解靶mRNA或抑制其表达，从而起到沉默基因、调控表达的作用。越来越多研究表明[7-9]，树突棘作为突触后成分，是突触后兴奋性传导的重要部位，突触重塑与脑中一些特殊表达的miR密切相关。

miR-134是脑内一种特殊的小RNA，广泛分布于海马神经元上，参与调控神经元的微观结构，负性调节树突棘的大小并通过调节树突功能而参与癫痫的病理发生过程。miR-134过表达可减小树突棘的体积[21-23]。对临床标本检测中，miR-134在难治性癫痫组表达明显低于非癫痫组；在动物实验中，miR-134 在癫痫大鼠模型成功点燃后 72h开始下降，直到 60d仍保持低水平，人及动物标本中这种在癫痫慢性期长期保持低水平的状态可能与癫痫慢性期重塑后的突触稳定性增加，及稳定的异常神经网络形成有关。 CREB存在于脑内所有细胞细胞核中，是转录因子蛋白家族的成员,参与了许多细胞内信号通路的信号传递,有研究表明CREB可促进记忆涉及新的突触联系生长或形成[24]。当细胞膜受到刺激时可引起胞内CREB的转录发生变化，而CREB则通过改变靶基因的表达，调节神经元所有类型蛋白的表达，进而影响单个神经功能最终影响整个神经回路。在发育成熟神经元中，转录因子CREB在树突生长[25]和活性调节树突的精细结构方面起重要作用[26]，其调节基因转录的关键步骤包括二聚体形成，结合到DNA反应原件以及磷酸化。CREB蛋白的生物学活性受磷酸化的调控，磷酸化作用可以增强CREB的转录活性。miR-134 通过转录后机制调节CREB蛋白的表达，在正常状态下，miR-134对CREB蛋白的表达起抑制作用，miR-134表达增加，对CREB的抑制加强[27]；反之，miR-134 表达降低对CREB蛋白的翻译抑制作用解除导致CREB表达升高，并增加其磷酸化的功能活性形式(pCREB)含量，具有功能活性的pCREB可促进下游miR-132表达上调进而激活相关信号通路，导致细胞骨架肌动蛋白聚合，增加树突棘的密度及体积最终调节突触的可塑性，促使苔藓纤维出芽形成异常神经网络，导致癫痫长期反复发作及耐药。在癫痫临床标本及动物模型中CREB与pCREB表达较对照组均明显且保持上升，CREB磷酸化生物活性增强表明CREB/pCREB可能参与了癫痫的病理发生发展过程。miR-134、CREB、pCREB在癫痫发生发展过程中的表达结果提示，miR-134/CREB/pCREB通路可能参与了癫痫慢性期突触可塑性变化的调节。

我们通过检测难治性颞叶癫痫患者及癫痫大鼠模型各时间点miR-134、CREB、pCREB的表达情况，在一定程度上推测miR-134/CREB/pCREB通路参与了人及大鼠癫痫的病理发生发展机制，为进一步探讨该通路下游信号通路对癫痫的影响提供了理论及实验基础。然而，在不同种属脑组织内，CREB表达以及功能激活所受到的诸多调控因素可能有所不同，故以miR-134/CREB/pCREB为基础探讨癫痫的病理发生发展机制还需更全面的深入研究。

(彩插4,5见彩插2,彩插6,7见彩插3)。

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