肠易激综合征大鼠模型的复制与评价

杜丽东，吴国泰，刘峰林，景琪，刘五州，任远

(1.甘肃中医学院，兰州 730000；2.甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，兰州 730000)

肠易激综合征(IBS)是现代社会环境下消化系统的多发病和常见疾病，表现为腹部不适或腹痛，胃肠动力异常，大便性状改变以及神经精神改变为特征的症候群，因其缺乏形态学、生化等特异改变，病因多样且发病机制尚不明确[1]。研究表明[2,3]，IBS病人中存在5-羟色胺(5-HT)、P物质(SP)、血管活性肠肽(VIP)等胃肠激素水平异常；多数患者伴有抑郁、焦虑、紧张等情绪变化。目前IBS动物模型均不能完全反应IBS复杂的发病机制和病理生理学特征[4,5]。本研究采用复合因素诱导大鼠建立IBS模型，为有效开展治疗IBS的实验研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级SD大鼠30只，雌雄各半，体重160～180 g，由甘肃中医学院实验动物中心提供【SCXK(甘)2011-0001】，在本中心无特定病原体(specific-pathogen free, SPF)实验室饲养【SYXK(甘)2011-0001】；SPF级饲料由北京科奥协力饲料有限公司供给，室温(20±2)℃，相对湿度30%～40%，12 h明/12 h暗交替，适应7 d后开始实验。

1.1.2 药品与试剂

1.1.3 仪器

冰柜(北京福意电器有限公司，中国)；烘箱(上海岛韩实业有限公司，中国)；振荡器(哈尔滨市东明医疗仪器厂，中国)；噪声测定仪(北京天安联合科技有限公司，中国)；电子天平(德国赛多利斯，德国)；GC-911-C-放射免疫计数器(中国科技大学实业总公司，中国)；自制敞箱(80 cm×80 cm×40 cm)；全自动生化分析仪(Alcyon300，美国)；组织包埋机(TEK TEC5，日本樱花)；全自动密闭式组织脱水机(Tek VIP 5，日本樱花)；石蜡切片机(Leica 公司，德国)。

1.2 方法

1.2.1 造模、分组与给药

SD大鼠随机分为正常组(10只)和模型组(20只)。正常组大鼠分性别每笼5只常规饲养，不给任何刺激。模型组大鼠每笼1只孤养，并加以不可预见性刺激，刺激因子包括禁水禁食、昼夜颠倒、冷刺激、热刺激、致痛、制动、高速震荡和噪声共8种，刺激因子在40 d内随机安排，每天1种，每种刺激出现5次，每种刺激不连续出现，造模40 d。刺激操作方法：①禁水禁食：24h内断水断粮；②昼夜颠倒：于7:00时将动物放入暗室中，不开灯使动物处于黑暗状态；至19:00时将暗室中照明灯打开，使动物处于光照状态，直至次日早7时取出；③冷刺激：将大鼠置于4℃冰柜中15 min后取出；④热刺激：将大鼠置于45℃的烘箱中15 min后取出；⑤致痛：用止血钳夹住大鼠距尾尖1 cm处(用力不宜过大，动物发出哀叫声即可)持续2 min；⑥制动：将大鼠置于固定器中5 h；⑦高速震荡：将大鼠放入振荡器中，高速水平震荡(110 r/min)15 min后取出；⑧噪声：将大鼠置于玻璃钟罩内，给150 dB闹铃刺激10 min。

将模型动物随机分为模型组、阳性组(匹维溴铵15.0 mg/kg体重，相当于临床成人日用量的7倍)，每组10只，按性别每笼5只常规饲养，于造模完成第2 天起按10 mL/kg体重容量灌胃给药，正常组与模型组大鼠灌胃等容量蒸馏水，每天1次，连续31 d。

1.2.2 检测指标与方法

三是交通运输主管部门应搭建统一的信息平台，实现航道主管部门建设的电子航道图与海事AIS数据，以及船闸运行单位、过闸船舶之间的信息互通共享。

(1)体重、摄食量： 在造模前、造模后和给药第9、19、29天上午9:00时加饲料100 g，次日9:00时称剩余饲料重，并称体重，计算24 h摄食量，摄食量=(食物总量-食物余量)/体重。

(2)排便情况：在造模前、造模后和给药第10、20、30天，在直径 60 cm 的圆盆中盛满水(水温10±1℃)，水中央放置直径10 cm的柱形平台，平台面高出水面约1 cm，将各组大鼠置于平台上，观察各大鼠2 h 内排便情况，定形粪便记录粒数，不定形或稀便记录排便次数；并对每粒或每次粪便性状评分，泄泻稀便计0分，软便无定形计1分，软便定形计2分，固体定形计3分，累积记录各大鼠2 h内粪便的评分。

(3)自主运动量[6]：自制敞箱(高40 cm，长宽均为80 cm，周壁为黑色，白色地面用黑线划分为面积相等的25块)，在暗的、无噪音、安静的房间进行。敞箱中央上方1 m处悬挂1个100 W灯泡。造模前、造模后和给药第10、20、30天将每只大鼠置于敞箱中央，以5 min内大鼠穿越地面方块数作为水平运动得分，以5 min内直立次数为垂直运动得分，将得分加和表示大鼠的运动量，每只大鼠测定一次。

(4)胃肠动力[7]： 第31天给药1 h后(事先已禁食不禁水12 h)，各组大鼠灌胃半固体糊每只2.0 mL(配制方法：16 g奶粉、8 g糖、5 g活性炭、10 g小鼠饲料粉(过80目筛)加入250 mL的5%的羧甲基纤维素悬液中，充分搅拌混匀)，30 min后股动脉放血，取血约1 mL加入抗凝管制备血浆，另取血约2 mL自然凝固4 h制备血清，颈椎脱臼处死大鼠，开腹，结扎幽门和贲门，取胃，用滤纸擦干后称全重，然后沿胃大弯剪开胃体，洗去胃内容物后擦干，称净重。迅速取出小肠，分离系膜，轻轻直铺于水平白色台面上，测量小肠全长(幽门至回盲部距离)及推进距离(幽门至半固体糊前沿的距离)。分别计算胃排空率和肠推进率。

胃排空率(%)=(灌胃半固体糊重 - 胃内残留糊重)/灌胃半固体糊重 × 100%，其中胃内残留糊重=胃全重 - 胃净重；肠推进率(%)=推进距离/小肠全长 ×100%

(5)血清或血浆、结肠匀浆5-HT、SP和VIP含量：大鼠动脉血室温静置4 h，低温离心3000 r/min×15 min，分离血清-20℃保存，抗凝血低温离心4000 r/min×15 min，分离血浆-20℃保存，按试剂盒说明书测定血清5-HT、血浆SP和VIP含量；测完肠推进后迅速摘取大鼠肛门上方3 cm处结肠1～2 cm，用生理盐水洗净内容物，称重后加入冷生理盐水手动研磨制备10%的组织匀浆，于4000 r/min×20 min离心，取上清-20℃保存，按试剂盒说明书测定组织匀浆5-HT、SP和VIP含量。

(6)血液生化指标检测及组织形态学检查：大鼠动脉血室温静置4h，低温离心3000 r/min×15 min，分离血清，用全自动生化分析仪测定谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肌酐(Cr)、血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、葡萄糖(GLU)的水平。

取大鼠胃窦组织和横结肠组织各一块，用4%的中性甲醛液固定，行H-E染色，光学显微镜下观察胃窦组织和肠黏膜病理组织学改变。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 体重变化

与正常组比较，造模后大鼠体重明显减轻(P<0.01)，给药第10天，各组大鼠体重均有增加，但与模型组差异均无统计学意义；给药第20天和第30天，阳性组大鼠增加显著(P<0.05)。见表1。

表1 IBS模型大鼠的体重变化±s，n=10)

2.2 摄食量变化

与正常组比较，造模后各组大鼠24 h内平均摄食量明显减少(P<0.01)，给药第10天，各组大鼠平均摄食量均有增加，但与模型组差异均无统计学意义；给药第20天和30天，阳性组大鼠增加显著(P<0.05，P<0.01)。见图1。

图1 IBS模型大鼠24 h内平均摄食量变化

2.3 排便情况

与正常组比较，造模后各组大鼠2 h内排便量明显增多(P<0.01)，给药第10天和20天，阳性组大鼠排便量减少(P<0.05)。造模后各组大鼠均出现稀便和无定形软便(P<0.01)，给药第10天，各组大鼠稀便减少，以无定形软便为主，阳性组组间差异有统计学意义(P<0.05)；给药第20天和30天，阳性组大鼠固体粒状粪便增多(P<0.05)。见表2，3。

表2 IBS模型大鼠排便量的变化±s，n=10)

表3 IBS模型大鼠粪便性状总评分的变化±s，n=10)

2.4 自主运动量的变化

与正常组比较，造模后各大鼠均出现蜷缩、喜卧、萎靡等状态，自主运动量减少(P<0.01)，给药第10天和第20天，阳性组大鼠运动量增加，但与模型组差异无统计学意义；给药第30天，阳性组大鼠运动量接近正常(P<0.05)。见表4。

表4 IBS模型大鼠自主运动量的变化±s，n=10)

2.5 胃肠动力的变化

与正常组比较，模型组大鼠胃排空率明显减小、肠推进率明显加快(P<0.01)，阳性组大鼠胃排空率明显增加、肠推进率明显减小(P<0.05)。见表5。

表5 IBS模型大鼠胃排空率和肠推进率的变化±s，n=10)

2.6 血清5-HT、血浆SP和VIP含量的变化

与正常组比较，模型组大鼠血清5-HT含量明显升高、血浆SP和VIP含量均明显降低(P<0.01)，阳性组大鼠血清5-HT含量明显下降、血浆SP含量明显升高(P<0.05),见表6。

表6 IBS模型大鼠血清5-HT、血浆SP和VIP含量的变化±s，n=10)

2.7 结肠匀浆5-HT、SP和VIP含量的变化

与正常组比较，模型组大鼠结肠匀浆5-HT和SP含量明显升高(P<0.01)，但结肠匀浆VIP含量变化不明显；阳性组大鼠结肠匀浆5-HT、SP和VIP含量明显下降(P<0.05，P<0.01),见表7。

表7 IBS模型大鼠结肠匀浆5-HT、SP和VIP含量的变化±s，n=10)

2.8 血清ALT、AST、Cr、TC、TG、TP、ALB、BUN和GLU含量的变化

与正常组比较，模型组和阳性组大鼠血清ALT、AST、Cr、TC、TG、TP、ALB、BUN和GLU含量，组间差异均无统计学意义,见表8。

表8 IBS模型大鼠血清生化检验结果±s，n=10)

2.9 IBS模型大鼠胃窦、结肠病理学观察

各组大鼠胃黏膜结构完整，无充血、水肿、溃疡、无炎症细胞浸润等组织学改变，胃窦平滑肌细胞及腺体细胞排列紧密，细胞形状规则，细胞间隙均匀；各组大鼠肠黏膜结构完整，无充血、水肿、溃疡、无炎症细胞浸润等组织学改变。见图2和图3(彩插1)。

3 讨论

目前IBS动物模型主要是以中枢(社会心理因素)或外周(肠道炎症、感染因素)为刺激靶点建立的IBS模型[8]，本研究根据IBS患者的发病特点和主要病因，遴选出8种致病因素作为模型复制的刺激因子，采用随机排列，使动物不可预见刺激作用，造模40d，基本出现了IBS临床病人具备的大体症状，且未见动物死亡，模型比较稳定，更适合进行药效评价和基础研究。

5-HT、VIP和SP是主要的胃肠激素，与IBS发生有直接关系，在调节内脏感觉和运动起重要作用[9]。IBS患者外周组织5-HT含量增高是内脏痛觉过敏的主要发病机制[10]；本研究发现，模型大鼠血清和结肠组织5-HT含量明显增高，匹维溴铵治疗30d后，阳性组大鼠血清和结肠组织5-HT含量明显下降，有利于提高内脏痛阈，消除肠道过敏；本研究中，IBS模型大鼠结肠组织SP含量增加，血浆SP含量降低。结肠中SP含量的增加可能与模型动物排便增加，胃肠运动亢进有关，与前期研究结果一致[11]；匹维溴铵能明显降低结肠组织SP含量，从而改善胃肠动力，消除肠道过敏。VIP 是抑制胃肠运动的主要神经递质之一，具有松弛胃肠平滑肌、促进肠道水和电解质的分泌的功能[12]。

综上所述，IBS模型大鼠表现为肠道敏感性较高，肠推进率较大，腹泻明显，脑肠轴5-HT和VIP过度分泌等病理生理特征，匹维溴铵具有促使其向正常水平恢复的作用。

(本文图2,3见彩插1。)

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