自身免疫性肝病患者外周血Th17与Treg细胞及其相关因子表达的研究

王 波，李 志，陶 晶，杨婷婷，邵思佳

(1.大连市中心医院 检验科,辽宁 大连116033；2.大连医科大学 检验医学院,辽宁 大连116044)

自身免疫性肝病(Autoimmune Liver Diseases，AILD)是以肝脏为相对特异性免疫病理损伤器官的一类病因尚未明确的慢性肝病，主要包括：自身免疫性肝炎(AIH)、原发性胆汁性肝硬化(PBC)和原发性硬化性胆管炎(PSC)以及这三种疾病中任何两者之间的重叠综合征[1]。人们对AILD的研究已深入到参与维持内环境稳定的细胞群中,特别是CD4+T细胞亚群可能与该病的发生发展有重要关系。本研究通过检测AILD患者外周血Th17 与Treg细胞亚群比例及其相关细胞因子的变化，探讨Th17、Treg 细胞的异常在AILD发病中的意义。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集2013年1月至2014年3月入大连市中心医院和大连市第六医院确诊的AILD患者46例，其中AIH为28例，PBC为18例。由于PSC患病率低，本文不对其进行分组分析。将患者组细分为AIH组和PBC组。AIH的诊断标准参照1999年国际AIH小组修正的AIH临床评分标准[2]。PBC诊断标准参照最新的2000年美国肝病学会(AASLD)关于PBC的临床指导建议[3]。46例患者中女38例，男8例,年龄范围24-75岁；其中AIH组共28例，男5例，女23例，平均年龄(50.78±25)岁；PBC组共18例，男3例，女15例，平均年龄(64.3±14)岁。20名健康体检者作为对照组(男5例，女15例)。三组对象一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 主要试剂与仪器

CD3FITC,CD4-PC5，CD4-FITC,CD25-PC5及固定破膜剂购自美国Beckman公司，PE-IL-17,PE-IFN-γ购自美国eBioscience公司，佛波酯(PMA)、离子霉素(Ionomycin)、莫能霉素(monensin)购自美国Sigma公司，IL-17和TGF-β的ELISA试剂盒购自美国R&D公司，流式细胞仪，酶标仪仪器为瑞典SUNRISE酶标仪。

1.3 实验方法

1.3.1 Th17细胞和Treg细胞的流式检测 分离出外周血单核细胞，在分离好的单核细胞及对照组中加入CD3和CD4的酶标抗体进行表面标记，用于Th17细胞的标记；同时取外周全血200 μl及对照组加入CD4和CD25的单抗，混匀避光孵育20 min。孵育好的全血样本PBS洗涤后，进行固定破膜。最后加入酶标FoxP3抗体进行细胞内细胞因子的标记，对照管加入FoxP3对照抗体，孵育30 min。而孵育后的PBMCs标本用RPMI-1640培养液洗涤，并加入到特殊培养液中(含新生牛血清、刺激剂、莫能霉素和离子霉素)，放入37°温箱孵育18-20 h。培养后的细胞及对照组同样进行固定破膜之后加入酶标IL-17抗体和对照抗体，孵育30 min后PBS洗涤。最后，应用流式细胞仪测定标记细胞的荧光强度。

1.3.2 酶联免疫法检测血浆中IL-17和TGF-β的浓度 按照ELISA试剂盒说明书进行细胞因子IL-17和TGF-β的测定。

1.4 数据处理

2 结果

2.1 Th17与Treg细胞的检测

AIH组和PBC组患者PBMCs中Th17细胞比例高于对照组(P<0.01),Treg细胞显著低于对照组(P<0.05)，见表1。

2.2 IL-17与TGF-β的表达

AIH组和PBC组患者IL-17的含量较对照组升高(P<0.05)，血清TGF-β的含量较对照组降低，有统计学意义(P<0.01)，详见表2。

表1 AIH组、PBC组与对照组外周血中Th17、Treg细胞所占比例

注：与对照组相比，*P<0.01，**P<0.05

表2 AIH组、PBC组和对照组血清中IL-17和TGF-β的含量

注：与对照组相比，*P<0.01，**P<0.05

3 讨论

AILD属于自身免疫性疾病,该病是以自身抗体存在于多种循环中为主要特点，女性易患，对糖皮质激素治疗良好，有显著的自身免疫的发病基础[4]。

Th17细胞由IL-23诱导分化生成，以产生IL-17为特征，可以抵抗Th1和Th2细胞不能抵抗的细胞外细菌和真菌感染，尽管Th17细胞在机体防御方面发挥重要作用，但近年来却因其参与介导许多自身免疫性疾病的发展而备受关注[5]。本实验初步研究了Th17及IL-17在AILD患者外周血中的表达，结果显示Th17及IL-17相比对照组均呈高表达，结果与国内外研究结果相符[6,7]。AIH组中Th17细胞增多，因为AIH病理变化主要表现为肝细胞损伤，Th17细胞可作为中介，通过数量增加，使更多的IL-22在炎症部位聚集从而限制肝脏损伤，进而维持机体的稳态。在多数研究中，AIH时Th17数量及其相关细胞因子明显增加与肝脏炎症程度及纤维化程度相关，这可能是Th17细胞和肝细胞之间的正反馈调节加剧了炎症过程功能性。PBC组中IL-17和Th17细胞显著增加，根据Harada等[8]研究，可知道 IL-17阳性细胞浸润主要存在于PBC患者受损胆管，故外周血Th17细胞和IL-17表达水平也明显升高。受损胆管周围细胞因子诱导IL-17的产生，从而促进Th17等炎症细胞的移行，加剧慢性胆管炎发生。

本研究中另一类CD4+T细胞-调节性T细胞(Treg)是1995年被Sakagochi等发现并命名。自身免疫病机制研究水平不断提升，人们已经认识到Treg细胞既能防止自身免疫疾病的发生，也能够限制免疫防御中T、B细胞过度活化，避免造成组织损伤[9]。细胞-细胞接触模式和分泌抑制性因子(如TGF-β等)等是Treg 细胞发挥免疫抑制作用的机制[10]。在本研究中，AILD患者Treg细胞和TGF-β含量相比对照组呈低表达且有统计学意义，这与已有研究结果相符合[11]。在正常条件下,肝内抗原提呈细胞激活CD4+T细胞可以被Treg抑制,而在感染条件下,肝细胞可以抵抗Treg的抑制作用,使免疫耐受转为免疫应答，进而患者组外周血Treg数量降低。除此之外，患者中TGF-β的分泌却明显低于对照组。正常状态下，Treg细胞与靶细胞直接接触引起本应该TGF-β分泌增加，但实验数据低于对照组，因而可推断AILD患者外周血Treg功能受损。由此推测，Treg在AILD发生发展中起保护作用，恢复患者免疫稳态，缓解患者的炎症通过调节其数量和功能得到改善。

维持机体免疫系统的平衡常通过CD4+T细胞亚群之间在功能和分化过程中相互抑制而完成的(如：Th1和Th2细胞)。通过本实验，我们也可推知Th17/Treg 细胞亚群也可能存在典型的互相抑制现象。实验表明在Th17升高的同时，Treg数量是减少的。正常机体内，初始CD4+T细胞分泌TGF-β参与免疫调节，在TGFβ和IL-6的共同诱导下分化Th17，分泌IL-17，参与炎症反应和自身免疫性疾病。AILD患者，肝细胞受损，TGF-β分泌降低，由于TGF-β同时分化Th17和Treg，但是Th17细胞和Treg的分化是相互排斥的，而IL-6、IL-10、IL-23等细胞因子决定了二者分化的相对比例。因此在研究AILD发病机制时应多考虑各种细胞因子的相互作用及微环境对细胞性质的影响等。

综上所述，Th17细胞与Treg细胞的失衡可能是导致AILD患者中肝脏自身免疫功能的紊乱，诱导AILD的产生的原因。评估外周血和肝脏内Treg细胞和Th17细胞环境下的二者功能及其相互关系将对自身免疫性肝病的发病机制提供新的治疗手段，通过对Th17细胞/Treg细胞平衡的干预影响，从而达到预防和治疗疾病的目的。

参考文献：

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[10]张 莹，姚咏明，盛志勇.调节性T细胞研究进展[J].生理科学进展,2007,38(1)：83.

[11]屠小卿，仲人前.自身免疫性肝病患者血清中转化生长因子β测定的临床意义[J].检验医学,2004，19(5)：427.