黄连阿胶汤对失眠大鼠血清Th1/Th2平衡的影响

，敏捷

(福建中医药大学，福州 350122)

黄连阿胶汤对失眠大鼠血清Th1/Th2平衡的影响

陈建，陈敏捷

(福建中医药大学，福州 350122)

目的 观察黄连阿胶汤对失眠模型大鼠Th1/Th2平衡的影响。方法 将36只SD大鼠随机分为3组,PCPA法复制失眠大鼠模型,ELISA法检测大鼠血清IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-10及IFN-γ/IL-4的水平。结果 模型组大鼠IFN-γ、IL-1β的水平明显下降(P<0.01)，IL-4、IL-10的表达则明显升高(P<0.01)，IFN-γ/IL-4比值降低(P<0.01)；黄连阿胶汤组IFN-γ、IL-1β的表达有不同程度的升高(P<0.05，P<0.01)，IL-4、IL-10的表达降低(P<0.05)，IFN-γ/IL-4比值升高(P<0.01)。结论 黄连阿胶汤能提高失眠大鼠Th1细胞因子的表达，降低Th2细胞因子的表达，促进Th1/Th2平衡向Th1方向偏移，是其治疗失眠的可能机制之一。

黄连阿胶汤；失眠；细胞因子；Th1/Th2平衡

失眠是临床常见的疾病，其发病机制较为复杂。近年来研究表明睡眠与免疫系统之间密切相关,Th1/Th2细胞平衡的偏移对睡眠产生一定的影响。黄连阿胶汤为《伤寒论》治疗少阴病“心中烦不得卧”的代表方，笔者在临床以其加减治疗失眠取得了较好的效果，为了进一步探索其作用机制,观察了黄连阿胶汤对失眠大鼠血清Th1细胞因子IFN-γ、IL-1β及Th2细胞因子IL-4、IL-10水平的影响，通过分析Th1/Th2平衡的偏移情况,从免疫学方面阐释其治疗失眠的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药物及制备 对氯苯丙氨酸(PCPA)(美国Sigma公司，批号:SHBC0245V)；黄连阿胶汤由黄连、黄芩、白芍、阿胶、鸡子黄组成，各药材均购自福建中医药大学国医堂，并经福建中医药大学中药鉴定教研室鉴定为正品。

1.1.2 试剂 水合氯醛(上海强顺化学试剂有限公司，批号：20120405)；大鼠IFN-γ ELISA试剂盒(RD公司，批号：20131001A)；大鼠IL-4 ELISA试剂盒(RD公司，批号：20131001A)；大鼠IL-1β ELISA试剂盒(RD公司，批号：20131001A)；大鼠IL-10 ELISA试剂盒(RD公司，批号：20131001A)。

1.1.3 实验动物 健康清洁级雄性SD大鼠36只，体质量180～200 g，由福建中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(沪)2012-0002。

1.1.4 主要仪器 低温高速离心机、DNP-9082型电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)、ELx50全自动酶标洗板机(美国宝特)、TECAN M200全自动酶标仪(奥地利)等。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 大鼠购进后，自由饮食摄水，自然光照，适应性饲养1周,随机分为3组，每组12只，即空白对照组、模型对照组、黄连阿胶汤组。

1.2.2 造模 对氯苯丙氨酸(PCPA)以弱碱性生理盐水(pH 7～8)配置成45 mg/mL混悬液备用。模型对照组、黄连阿胶汤组大鼠每日上午腹腔注射PCPA混悬液1 mL/100 g，空白对照组大鼠腹腔注射同体积的弱碱性生理盐水，连续注射2 d。实验中观察到第1次腹腔注射PCPA混悬液30 h后大鼠出现昼夜节律消失，白天活动频繁，与空白对照组有明显不同，说明模型复制成功。

1.2.3 给药 黄连阿胶汤各药按原方用量比例缩小5倍,即50 g相当于3 g，将除鸡子黄以外的各药加适量的水浸泡1 h，煮沸30 min过滤, 将滤渣再加适量水煎煮10 min后，合并2次滤液，加入阿胶烊化，然后纳入鸡子黄搅拌均匀,浓缩至每毫升煎液相当于原药材1.03 g，4 ℃冰箱保存备用。每组动物于每日上午9：30左右灌胃，以成人(按60 kg算)每公斤体质量的6倍给药，即正常对照组与模型对照组分别用生理盐水灌胃1.03 g/(kg·d)，中药组用黄连阿胶汤煎液灌胃1.03 g/(kg·d)，1次/d,连续7 d。

1.2.4 样品采集与处理 各组大鼠最后1次给药24 h后，用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，立即腹主动脉采血5 mL，静置1 h后，3 000 r/min离心5 min，取上清液，置于-80 ℃冷冻保存。采用ELISA法严格按试剂盒说明对IFN-γ、IL-4、IL-1β、IL-10的水平进行检测。

2 结果

2.1 一般情况 PCPA腹腔注射30 h后，大鼠兴奋性增高，烦躁不安，活动频繁，攻击性增强，对外界的声光刺激较为敏感，昼夜规律基本被破坏，说明失眠模型复制成功。

2.2 各组大鼠血清IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-10及IFN-γ/IL-4比较 大鼠造模后血清IFN-γ含量明显降低，与空白组比较有统计学意义(P<0.01);黄连阿胶汤组大鼠血清IFN-γ表达升高，与模型组比较有统计学意义(P<0.05)。与空白组比较,模型组大鼠血清IL-1β含量明显降低，有统计学意义(P<0.01)；黄连阿胶汤组大鼠血清IL-1β含量较模型组明显升高，有统计学意义(P<0.01)。与空白组比较，模型组大鼠血清IL-4含量升高，有统计学意义(P<0.01)；黄连阿胶汤组大鼠血清IL-4含量较模型组降低，有统计学意义(P<0.05)。模型组大鼠血清IL-10含量较空白组明显升高，有统计学意义(P<0.01)；黄连阿胶汤组大鼠血清IL-10含量较模型组降低，其差异有统计学意义(P<0.05)。与空白组比较，模型组大鼠血清IFN-γ/IL-4比值降低,有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较,黄连阿胶汤组大鼠血清IFN-γ/IL-4比值升高，有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠血清IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-10及IFN-γ/IL-4比较

注：与空白组比较，##P<0.01；与模型组比较,△P<0.05,△△P<0.01

3 讨论

失眠属祖国医学“不寐”“目不瞑”“不得眠”等病的范畴，总与阳不交阴，阴阳不和有关，此即“治病求本，本于阴阳”之谓。对于失眠的认识虽肇端于《黄帝内经》，但对失眠的辨证论治则始自于《伤寒论》。《伤寒论》所载之黄连阿胶汤原为治疗少阴热化“心中烦不得卧”的代表方，方中黄连、黄芩定泻心火，抑亢阳；芍药、鸡子黄、阿胶补真阴，诸药相合则抑阳而交阴，使阴阳相交，与失眠之阳不入阴，阴阳不和的病机丝丝入扣。临床以之加减治疗失眠，取得了良好的效果。 从现代研究来看，失眠的发病机制非常复杂，涉及到中枢神经系统众多的神经网络和一系列神经介质、神经内分泌和神经调节物质。近来研究表明，睡眠与免疫系统之间存在密切的联系,Th1/Th2细胞因子动态平衡对睡眠起着重要的调节作用。人类Th1细胞主要分泌IFN-γ、IL-1β、TNF-β等细胞因子，其中以IFN-γ为代表；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-10等细胞因子，其中以IL-4为代表[2]。IFN-γ与IL-4的比值即IFN-γ/IL-4可反映Th1/Th2的偏移情况，常作为研究Th1/Th2失衡的主要指标[3]。在正常情况下Th1与Th2细胞通过分泌细胞因子进行相互调节与抑制，从而维持机体平衡。当Th1细胞因子表达增加，即Th1/Th2细胞因子平衡向Th1方向偏移时则睡眠增加。动物实验也表明增加动物脑内或血浆中IL-1β、IFNγ及TNFα可增加SWS睡眠,而降低脑内中上述细胞细子则减少SWS睡眠。Th1细胞细子促进睡眠的作用可能与核转录因子(NF-κB)信号通路的激活有关,IL-1β、IFNγ、TNFα都有强烈激活NF-κB的作用，NF-κB激活后氧化亚氮合成酶活性提高，脑组织中NO水平增高,从而促进NREM睡眠。NF-κB激活后还可增加IL-12、COX-2的表达，IL-12是独立调节睡眠的免疫细胞因子[4],而COX-2催化产生的PDG2则可直接促进NREM睡眠。Th2细胞因子表达增加,即Th1/Th2细胞因子平衡向Th2方向偏移时则有抑制睡眠的作用，其作用机制主要是通过抑制NF-κB的活化,通过NF-κB信号通路影响SWS睡眠。近年来，学者[5-7]开始关注Th1/Th2细胞因子失衡对失眠的影响，研究[8]表明，失眠患者IFN-γ水平降低，IL-4水平升高，IFN-γ/IL-4比值降低，Th1/Th2细胞因子平衡向Th2方向漂移，可能是失眠发生的免疫学机制。

笔者前期在临床上用黄连阿胶汤加减治疗失眠，取得了良好的效果，此次实验以公认的PCPA法复制失眠大鼠模型[9]，观察了黄连阿胶汤对失眠大鼠Th1/Th2细胞因子表达的影响，试图从免疫学角度揭示其治疗失眠的可能机制。从实验结果来看,模型组大鼠IFN-γ、IL-1β的水平明显的下降，IL-4、IL-10的表达则明显的升高,IFN-γ/IL-4比值降低，Th1/Th2细胞因子平衡向Th2占主导的方向偏移；黄连阿胶汤组IFN-γ、IL-1β的表达有不同程度的升高，IL-4、IL-10的表达降低,IFN-γ/IL-4比值升高，Th1/Th2细胞因子平衡向Th1占主导的方向偏移。由此可见，黄连阿胶汤能够促进失眠大鼠血清Th1细胞因子的表达，降低Th2细胞因子的表达，从而使Th1/Th2平衡向Th1方向漂移而达到治疗失眠的作用,这可能是黄连阿胶汤治疗失眠的免疫学机制之一。

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EffectsofHuanglianEjiaoDecoctiononserumTh1/Th2balanceofinsomniarats

CHEN Jian,CHEN Minjie

(Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou 350122,China)

ObjectiveTo observe the effect ofHuanglianEjiaoDecoctionon serum Th1/Th2 balance of insomnia rats.Methods36 SD rats were randomly divided into 3 groups.The model of insomnia rats was established by PCPA method.The level of IFN-γ,IL-1β,IL-4,IL-10 and IFN-γ/IL-4 in rats serum were determined with enzyme linked immunosordent assa (ELISA) method at the end of the experiment.ResultsThe level of IFN-γ,IL-1β reduced obviously (P<0.01,the expression of IL-4 and IL-10 obviously increased(P<0.01,and the ratio of IFN-γ/IL-4 decreased in the model group;The expression of IFN-γ,IL-1β increased in different degrees(P<0.5,P<0.01),the expression of IL-4,IL-10 reduced(P<0.05),the ratio of IFN-γ/IL-4 increased(P<0.01) inHuanglianEjiaoDecoctiongroup.ConclusionHuanglianEjiaoDecoctioncan increase the expression of serum Th1 cytokines and decrease the expression of serum Th2 cytokines in insomnia rats.The possible mechanism ofHuanglianEjiaoDecoctionin the treatment of insomnia may be achieved by promoting the balance of the Th1/Th2 move to Th1 direction.

HuanglianEjiaoDecoction;insomnia;cytokine;Th1/Th2 balance

10.13463/j.cnki.cczyy.2014.05.007

福建省教育厅A类科技项目(JA11136)。

陈 建(1974-)，男，医学博士，副教授，硕士研究生导师。研究方向：经方辨治情志疾病研究。

R285.5

：A

：2095-6258(2014)05-0779-03

2014-05-07)