胃癌中CDK6 mRNA表达变化研究

潘新民，徐国辉，秦豪杰，高林波，张 林

·基础医学·

胃癌中CDK6mRNA表达变化研究

潘新民1，徐国辉1，秦豪杰1，高林波2，张 林3

目的探讨胃癌中CDK6 mRNA含量的变化。方法采用实时荧光定量PCR检测胃癌及癌旁组织中CDK6 mRNA的表达。结果胃癌组织中CDK6 mRNA 含量为0.433±0.468，癌旁组织为1.304±1.206，两组相比，差异具有统计学差异(P<0.05)。结论CDK6 mRNA在胃癌癌旁组织表达水平明显高于癌组织。

胃癌；CDK6；实时荧光定量PCR

CDKs是细胞周期调控网络的中心，失活或异常表达时可导致细胞癌性转化[1]。CDK6是调控细胞G1-S期关键因素之一[2]，人类许多肿瘤的发生与CDK4或CDK6(Cyclin dependent kinase 6,CDK6)相关[3-6]。研究发现CDK6蛋白在肝癌[7]、淋巴癌[8]、宫颈癌[9]、皮肤瘢痕癌[10]等表达呈弱阳性至表达增强，而在88%的肠癌组织[11]、69%的胃癌组织中[12]等呈阳性表达，但未见有相关CDK6 mRNA定量的报道。通过实时荧光定量PCR技术通过反转录RNA，经聚合酶链式反应实时监测cDNA的放大[13]。因为扩增指数增长期测量值与特异cDNA(RNA)起始量存在相关性，在扩增的指数增长期测量扩增产物实现定量检测[14]。本研究运用实时荧光定量PCR检测CDK6 mRNA在胃癌组织中的表达，为探索CDK6在胃癌发病中的作用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 试剂 PrimerScriptTMRT reagent Kit(Takara Co.,Japan)，SYBR®PremixExTaqTMⅡ Kit(TaKaRa Co.,Japan)，RNAiso Reagent(Takara Co.,Japan)DEPC (GIBCO Co.,USA)，异丙醇、氯仿、无水乙醇等其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 实验仪器 ABI 7500荧光 RT-PCR仪(ABI Co.,USA)，低温高速离心机(Eppendorf Co.,Germany)，微量移液器(Eppendorf Co.,Germany)，XH-89旋涡振荡器(浙江乐清仪器厂)，NANODROP 1000超微量紫外分光光度计(Thermo Scintific,USA)，-80℃冰箱 (SANYO Co.,Japan)，BS210S型电子天平(Sartorius Co.,USA)，纯水体系(MilliPure Co.,France)，超声匀浆器(宁波新芝公司)。

1.1.3 组织标本 采集胃癌癌组织及癌旁组织13例，男性6例，女性7例，平均年龄(61.8±11.4)岁。

1.2 方法

1.2.1 胃癌组织标本总RNA提取 操作简介：取经DEPC处理干燥的EP管置于冰上，每管加入500 μL RNAisoTM Plus，分别取20 mg胃癌癌组织及癌旁组织，超声匀浆后静置5 min。12 000 g 4℃离心5 min。移液器吸出上清加入氯仿(RNAisoTM Plus的20%体积量)，振荡充分乳化后离心5 min，吸取上清液转移加入等体积异丙醇混匀，室温静置10 min。离心10 min后弃上清，缓慢加入75%乙醇1 mL。离心5 min，室温下干燥沉淀5 min，加入30 μL DEPC双蒸水，待RNA沉淀完全溶解后-80℃保存。抽取1 μL采用NANODROP 1000超微量紫外分光光度计进行RNA定量检测。

1.2.2 RNA的反转录反应 按PrimerScriptTMRT reagent Kit组份配制反转录反应液(在冰盘上操作)：5×PrimeScriptTM Buffer 2 μL， PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I 0.5 μL，Oligo dT Primer 0.5 μL，Random 6 mers 0.5 μL，Total RNA 1 μL，RNase Free dH2O 5.5 μL，充分混匀，按照37℃ 15 min，85℃ 5 s进行反转录，反应产物-20℃保存备用。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测CDK6 mRNA胃癌中的表达 ①引物的设计与合成：根据GeneBank数据库中CDK6基因mRNA的序列(AK313491)设计CDK6的引物如下：

上游引物: 5’-TCAGGTTGTTTGATGTGTGC-3’

下游引物: 5’-TCCTTTATGGTTTCAGTGGG-3’

根据GeneBank数据库中GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因mRNA的序列(AF261085)设计GAPDH的引物如下：

上游引物: 5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’

下游引物: 5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’

②实时荧光定量PCR扩增标准曲线的制备：以单链cDNA作为模板进行常规PCR反应，分别扩增CDK6和GAPDH， PCR反应条件：94℃预变性4 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环，最后72℃延伸10 min。扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定条带位置与大小正确后，参照BioTake PCR产物回收试剂盒中的操作说明，回收、纯化PCR产物，经测序证实其序列与GeneBank中CDK6及GAPDH序列一致。将所得样品用easy dilution RNase水1、10、100、1 000、10 000和100 000倍等比稀释，制作成为标准品用于real time PCR标准曲线的制备。③待测组织中CDK6 mRNA 检测和定量分析：采用双标准曲线法，按照Takara Co.SYBR®PremixExTaqTMⅡ说明书进行操作。使用20 μL反应体系进行real time PCR检测胃癌及癌旁组织CDK6 mRNA含量。充分混匀后，在ABI Prism®7500型荧光定量PCR仪上，设置反应条件：95℃10 s，95℃5 s，60℃ 34 s，40个循环；反应结束后增加融解。曲线分析：95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s，60℃15 s；每个样本复孔3个，得到标准曲线、融解曲线和样本的相对定量。每个样本的内参基因GAPDH在相同条件下扩增，附加阴性对照作为质量控制。统一基线基准，在与基线交点的循环次数(Ct) 值为纵坐标，各标准管浓度的对数值为横坐标，制作标准曲线，选择PCR基线进行数据分析和修正，根据待测样本的Ct 值求出相应基因的相对表达量。以标本CDK6相对表达量/对应GAPDH相对表达量，得到校正后每个样本CDK6 mRNA的表达水平。

2 结果

2.1 实时荧光定量PCR引物特异性验证在260 nm和280 nm超微量紫外分光光度计测定吸光值，提取的纯RNA的OD260/OD280比值在1.8～2.1之间。融解曲线分析实时荧光定量PCR扩增产物及引物二聚体，验证PCR产物的特异性。本组数据显示融解曲线单一峰型，说明CDK6与GAPDH荧光定量PCR扩增引物特异性好，未见引物二聚体等非特异性扩增。

2.2 实时荧光定量PCR扩增效率检测取1份样品，分别做1、10、100、1 000、10 000和100 000倍等比稀释，然后分别作目的基因CDK6和内参基因GAPDH标准曲线。扩增完成后，可直接测出CDK6和GAPDH对应的R2，分别为0.994和0.996，斜率分别为-3.336和-3.359。根据公式E=10-1/K-1(E为扩增效率，K为标准曲线的斜率)计算得到扩增效率分别为：99.42%(CDK6)和98.48%(GAPDH)，符合相对定量法的使用斜率。

2.3 CDK6在结直肠癌和胃癌组织中的表达CDK6 mRNA在胃癌癌旁组织表达水平为1.304±1.206，明显高于癌组织0.433±0.468(t=-2.669，P=0.02)。

3 讨论

在不同肿瘤或肿瘤的不同类型中CDK6的表达可能并不相同，在子宫内膜腺癌[9，16]、鼻咽癌[17]CDK6表达增高，并且与肿瘤分化程度和临床分期等有关，但在不同的淋巴瘤中，CDK6的表达并不相同[8，15]。在88%的肠癌组织[11]、69%的胃癌组织中[12]等呈阳性表达。有研究使用CDK6 mRNA探针显示有少部分肝癌细胞CDK6 mRNA呈弱阳性表达[7]，可能与抑制因子的缺失或mRNA降解有关，使CDK6 蛋白的表达异常，出现细胞增殖、肿瘤的发生、转移和浸润等。通过实时荧光定量PCR发现CDK4 mRNA在鼻咽癌[18]和乳腺癌[19]中的表达上调，并且与部分临床特征呈正向相关趋势。然而，尚未见CDK6 mRNA在胃癌中的表达研究。

荧光染料能监测任何dsDNA序列的扩增，不需要设计探针，检测成本相对较低。但因为它能与非特异的dsDNA(如引物二聚体)结合而产生假阳性信号。对于引物二聚体非特异性结合常使用融解曲线分析扩增的特异性。实验显示融解曲线仅呈现单一平滑峰型时，标准品与样品重合良好，表明扩增特异性良好[20]。PCR阈值是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值设置一般是3～15个循环的荧光信号标准偏差的10倍。利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，以未知样品的Ct值从标准曲线上得出该样品的起始拷贝数[21]。本研究采用GAPDH作为内参[22]，CDK6与GAPDH融解曲线呈单一平滑峰型，扩增效率均衡一致，复孔均一性好，阈值在正常范围内。

本研究检测到CDK6 mRNA在胃癌癌旁组织中表达明显高于癌组织，考虑到本研究抽样及样本含量，扩大样本量或运用其他实验方法验证将有助于了解其发生发展的详细机制。

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TheExpressionofCDK6mRNAinGastricCancer

PAN Xin-min,XU Guo-hui,QIN Hao-jie,et al

(College of Forensic Medicine,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

ObjectiveTo explore the expression ofCDK6 mRNA in gastric cancer.MethodsThe expression ofCDK6 mRNA was detected by real-time fluorescence quantitative PCR with GAPDH as an internal reference.ResultsThe expression ofCDK6 mRNA was 0.433±0.468 in gastric cancer tissues and 1.304±1.206 in normal adjacent tissues respectively.It was statistically significant between gastric cancer tissues and normal adjacent tissues (P<0.05).ConclusionThe expression ofCDK6 mRNA is higher in normal adjacent tissues of gastric cancer than that in cancer tissues.

gastric cancer;cyclin dependent kinases 6;real-time fluorescence quantitative PCR

国家自然科学基金项目(81302149)， 河南省科技厅自然科学基金项目(132300410105)

2014-01-10

1.河南科技大学法医学院，河南洛阳 471003 2.四川大学华西第二医院，四川成都 610041 3.四川大学华西基础医学与法医学院，四川成都 610041

潘新民(1969-)，男，河南洛阳人，副教授，从事法医病理、分子病理学工作。

张林，男，教授，博士生导师，E-mail：zhanglin@scu.edu.cn

Q754，R735.2

A

1672-688X(2014)02-0081-03