应用液体蛋白芯片—飞行时间质谱系统研究乳腺癌血清差异蛋白表达

熊万成，高春芳，范乃军

应用液体蛋白芯片—飞行时间质谱系统研究乳腺癌血清差异蛋白表达

熊万成1，高春芳2，范乃军2

目的分析乳腺癌与健康人血清蛋白质谱差异，筛选特异性蛋白标志物，建立乳腺癌诊断预测模型，评价其诊断价值。方法将58例乳腺癌和57例健康女性的血清，随机分为建模组和验证组，应用弱阳离子纳米磁珠(MB-WCX)结合基质辅助激光解吸离子飞行质谱(MALDI-TOF-MS)技术建立血清蛋白质谱，选择遗传算法建立乳腺癌诊断预测模型，利用诊断模型对验证组进行盲筛验证。结果通过蛋白质谱，筛选出29个显著差异蛋白质峰(P<0.05)。其中乳腺癌中表达上调2个，表达下调27个，利用其中8个差异峰(质荷比分别为698.3、797.37、1 449.56、1 466.65、1 520.74、1 584.55、2 379.26、2 739.69)建立诊断模型，获得了96.55%(28/29)的敏感性和96.42%(27/28)的特异性，经独立样本双盲验证，得到灵敏度为 93.10%(27/29)，特异度为96.55%(28/29)。结论应用弱阳离子纳米磁珠联合MALDI-TOF-MS技术可筛选出血清蛋白质谱中的差异蛋白质，据此建立的诊断模型具有较高的敏感性和特异性，对于乳腺癌的辅助诊断有一定的临床意义。

乳腺癌；基质辅助激光解吸离子飞行质谱；蛋白质组学；磁珠；诊断模型

目前乳腺癌为女性疾病中发病率最高的恶性肿瘤之一，且发病率正以每年3%的速度递增，给世界范围内患乳腺癌的女性患者带来沉重的经济、社会和思想负担。若能对其早期发现、早期诊断，在治疗上可以取得良好效果，预后也可以得到明显的改善。而目前用于乳腺癌的筛查及诊断方法在临床上应用效果并不理想[1-2]。随着肿瘤诊断技术水平的不断提高，乳腺癌的筛检和早期诊断正在从传统的检测方法向基因诊断和分子生物学方向发展[3-4]。从血清中寻找确切可用于乳腺癌诊断的特异性生物标志物是蛋白组学研究的主要方向之一，液体芯片—飞行质谱技术为乳腺癌标志物的筛选提供了理想的技术平台。

1 材料与方法

1.1 研究对象乳腺癌组选自解放军第150中心医院2010年10月～2012年5月住院患者，经组织病理学检查确诊；乳腺癌组58例，均为女性，年龄29～78岁，中位年龄53岁；采血前未行放、化疗及手术等干预治疗；根据2003年第6版AJCC乳腺癌TNM临床分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期20例，Ⅲ期病人23例。正常对照组57例，均为女性，年龄44～76岁，中位年龄58岁；选自本院同期体检中心健康查体者，检查结果证实无乳腺疾病。所有研究对象采血前均签署了知情同意书，经解放军第150中心医院伦理委员会审核通过。以上所选患者均经临床检查排除重要脏器(心、肺、肝和肾等)疾病和明确无内分泌疾病。采集志愿者清晨空腹静脉全血3 mL(不加抗凝剂 )，室温静置20 min后，以 2 000 r/min离心15 min，将淡黄色上层血清取出并分装EP管，冻存于-80℃冰箱。实验开始前，样品常温解冻，待用。乳腺癌患者于术前当日清晨采集，处理方法同上。按照完全随机化的方法，将乳腺癌患者与健康志愿者分为建模组与验证组，其中，建模组包括乳腺癌29例与健康志愿者28例，验证组乳腺癌患者与健康志愿者均为29例。

1.2 试剂与仪器基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱仪(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS) MALDI-TOF-MS Autoflex-Ⅲ、弱阳离子纳米磁珠(MB-WCX)试剂盒、α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-cyano-4- hydroxycinnamic acid， HCCA) 和混合标肽均购自德国Bruker Daltonics公司，乙腈(ACN)、 三氟乙酸(TFA)、SPA(Sinapinic acid)、 尿素、DTT、CHAPS、Tris-HCl、NaAC等购自美国 Sigma 公司。

1.3 方法

1.3.1 WCX磁珠纯化分选多肽 磁珠试剂盒存放: 4℃冰箱冷藏。磁珠结合血清中的蛋白/多肽操作流程: ①取出磁珠悬浮液上下颠倒摇动1 min，使之完全混和均匀，备用；②向样品管中加入10 μL磁珠结合缓冲液(BS)；③再加入10 μL磁珠混悬液混和均匀；④取冻融的待测血清5 μL吸打混匀5 次以上；⑤室温静置5 min；⑥样品管放进磁珠分离器，使磁珠贴壁1 min直到液体清亮；⑦吸取上清；⑧加入磁珠清洗缓冲液(WS)100 μL，在磁珠分离器前后两孔间反复移动样品管10 次；⑨样品管静置于磁珠分离器中，使磁珠贴壁1 min直到液体清亮，吸取上清，在吸取的过程中避免搅浑悬浮液而吸走磁珠；⑩重复⑧⑨步骤2次，最后一次加样枪吸去全部悬浮液。洗脱磁珠结合蛋白: ①向结合了蛋白的磁珠样品中加入5 μL 磁珠洗脱缓冲液(ES)，反复吸打混匀磁珠；②样品管静置于磁珠分离器中2 min，使磁珠贴壁，与液体完全分离，取上清液移入0.5 mL 样品管；③向0.5 mL样品管中加入稳定缓冲液(SS)5 μL吸打混匀；④加入稳定缓冲液的洗脱液可以用来直接质谱分析或-20℃冻存24 h内质谱分析。

1.3.2 质谱检测与数据采集 采用Autoflex-Ⅲ MALDI-TOF-MS仪器，应用线性模式，设定仪器参数：离子源1电压：20.0 kV，离子源2电压：18.6 kV，棱镜电压：6.6 kV，脉冲离子间隔：120 ns，离子化需晶体激光频率：200 Hz，基质信号抑制质核比：600 Da，采集范围：相对分子量范围600～18 000。应用Flexcontrol 3.3软件采集质谱数据，Flexanalysis3.3软件对所采集质谱图进行优化处理，包括质谱图的平滑、衰减及标峰处理，并输出含有质荷比值和峰强度的Excel格式数据；ClinproTools2.2对数据进行统计学处理，以P<0.05为差异有统计学意义，分析建模组样本质谱图，选择遗传算法(GA)建立诊断模板，计算灵敏度与特异度。

2 结果

2.1 差异蛋白质定量分析建立建模组样本(乳腺癌37例，正常人35例)血清蛋白质谱，在分子质量600～18 000范围内共检测到79个蛋白峰。比较分析乳腺癌与健康志愿者之间差异蛋白质谱，共发现29个蛋白峰有显著性差异(P<0.05)。其中在乳腺癌中表达上调峰2个，表达下调峰27个，见表1。

2.2 诊断模板的建立利用ClinproTools2.2中遗传算法(GA)建立了由8个差异表达蛋白(质荷比分别为698.3、797.37、1 449.56、1 466.65、1 520.74、1 584.55、2 379.26、2 739.69)组成的诊断模型，能有效地将乳腺癌和正常人区分开，获得了96.55%(28/29)的敏感性和96.42%(27/28)的特异性。分子量为1 449.56、1 520.74、1 584.55及2 739.69 的4个蛋白诊断乳腺癌的ROC曲线下面积分别为0.91、0.81、0.87及0.79。见图1。

表1 在乳腺癌中表达差异有统计学意义的蛋白

A：质荷比1 449.56；B：质荷比1 520.74；C：质荷比：1 584.55；D：质荷比2 739.69

2.3 诊断模板的评价为进一步评价本研究中所建立诊断模板的诊断价值，利用诊断模板对验证组样本进行双盲验证，结果显示其灵敏度为93.10%(27/29)，特异度为96.55%(28/29)，约登指数为0.89。对软件自动筛选出最具鉴别分类能力的两个蛋白(质荷比为1 450和2 740)进行分析，以蛋白1 450为X轴，2 740为Y轴建立坐标系的样品分布图(坐标值代表相应蛋白丰度)，可见两组样品交差区域较少，说明两个蛋白的分组能力良好，见图2。

图2 质荷比为2 740和1 450两个蛋白对乳腺癌和健康对照组蛋白丰度分布图

3 讨论

乳腺癌的发病率占全身恶性肿瘤的7%～10%，严重危害了女性的身心健康。若能对其早期发现、早期诊断、早期治疗，在治疗上可以取得良好效果。但目前的检查手段灵敏度、特异度及受检对象的顺应性均不高[5]。目前临床常用的肿瘤标记物，如CAl5-3、CAl25、CAl99和CEA等，在乳腺癌的早期诊断中应用价值并不高[6]。将CAl5-3、CAl25和CEA等几个指标联合检测，在一定程度上可以提高早期乳腺癌的诊断率，但敏感度也只有53.8%[7]，依然不能满足临床早期诊断乳腺癌的需要。

液体芯片—飞行时间质谱技术是蛋白质组学最新研发并用于临床研究的技术成果,具有准确度高、分析快速、高通量、灵敏度高、重复性好和分辨率高等特点[8-11]，该技术已经在多个系统的肿瘤中获得了丰硕的研究成果：其中α-纤维蛋白原(FPA)、补体C3f、激肽原等均在多种肿瘤，如头颈部鳞癌(HNSCC)、口腔癌[12]、结直肠癌[13]、胃癌[14]、膀胱癌、前列腺癌[15]、乳腺癌[16]等中呈现差异表达，表明其有成为新的肿瘤标志物的潜能。另外，该技术在检测系统性红斑狼疮(SLE)、急性淋巴细胞白血病、哮喘[8，17-18]、肺炎[19]病人中也有很好的应用。

本研究采用联合应用弱阳离子交换磁珠(MB-WCX)和MALDI-TOF质谱技术检测乳腺癌和正常人血清蛋白质谱，通过比较分析发现了79个差异蛋白，其中有29个差异蛋白具有统计学意义。利用ClinproTools2.2中遗传算法(GA)建立了由8个差异表达蛋白(Mr分别为698.3、797.37、1 449.56、1 466.65、1 520.74、1 584.55、2 379.26、2 739.69Dr)组成的诊断模型，能有效地将乳腺癌和正常人区分开，获得了96.55%(28/29)敏感性和96.42%(27/28)的特异性。利用诊断模板对验证组样本进行双盲验证，结果显示其灵敏度为93.10%(27/29)，特异度为96.55%(28/29)，约登指数为0.89。上述结果明显优于目前临床常用的肿瘤标志物，如CAl5-3、CAl25、CAl99和CEA等及其联合检测效能。值得关注的是，在比较乳腺癌患者与健康女性的血清蛋白质时，质荷比(M/Z)为1 449.56、1 584.55的两个蛋白差异显著(P<0.0001)，有望成为诊断乳腺癌新的肿瘤标志物。

本研究中发现了1组对乳腺癌早期诊断有价值的蛋白质/多肽，对其进行鉴定和功能分析将有助于阐明乳腺癌发生、发展机制，但由于技术上的局限性或者现有的数据库的不完整，对蛋白质的鉴定工作未取得满意结果。因此，今后的研究方向就是不断地采用新技术、新方法对差异蛋白进行鉴定和功能描述。

综上所述，乳腺癌患者与正常对照血清之间存在着具有显著性差异的蛋白质，联合应用弱阳离子交换磁珠和MALDI质谱技术结合遗传算法(GA)等生物信息学、生物统计学方法有望筛选出乳腺癌诊断标志蛋白。本课题的研究成果为乳腺癌的发生、发展研究提供了新的线索，为乳腺癌的辅助诊断提供了新的思路。

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ProteomicProfilingofBreastCancerinSerumUsingMagneticBeadBasedSamplefractionationandMALDI-TOF-MS

XIONG Wan-cheng,GAO Chun-Fang,FAN Nai-Jun

(Xinxiang Medical University,Xinxiang 453000,China)

ObjectiveTo analyze the differentially expressed proteins in the serum of breast cancer patients and control group so as to filter out protein markers of breast cancer ,and to build a predictive model of breast cancer.MethodsSerum samples were collected from 58 patients with breast cancer and 56 healthy controls,and randomized into model construction group and validation group.WCX Magnetic bead and matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) technology were used to detect serum samples from patients with breast cancer and healthy individuals.Flex Analysis software was used to deal with mass spectrometry data.The model was built using ClinproTools2.2 software and was further evaluated in a blind test for reliability.ResultsTwenty-nine differentially expressed proteins in serum were screened by comparing serum protemic spectra between breast cancer patients and healthy individuals,including 2 up-regulated proteins and 27 down regulated ones.Eight proteins (M/Z 698.3，797.37，1 449.56，1 466.65，1 520.74，1 584.55，2 379.26，2 739.69) were obtained for developing a ClinProt model which was able to classify breast cancer patients and healthy individuals with a sensitivity of 96.55%(28/29)and a specificity of 96.42%(27/28).In a double blind validation,the ClinProt model yielded a sensitivity of 93.10%(27/29) and a specificity of 96.55%(28/29).ConclusionCombination of MALDI-TOF-MS and WCX magnetic bead technology can directly screen the differential expressed protein from healthy controls and breast cancer,and these proteins are suitable for diagnosis of early-stage breast cancer.They have clinical significance for enhancement of sensitivity and specificity of breast cancer diagnosis.

breast cancer；MALDI-TOF-MS；proteomics；magnetic bead；diagnostic pattern

2014-03-27

1.新乡医学院，河南新乡 453003 2.中国人民解放军第150中心医院全军肛肠外科研究所，河南洛阳 471000

熊万成(1984-)，男，河南驻马店人，在读硕士研究生，从事肿瘤的蛋白组学研究工作。

R730.43,R737.9

A

1672-688X(2014)02-0089-05