鼻咽癌中碱性成纤维细胞生长因子的实验研究

陈广理，龚树生，陈 沛，罗凌惠

鼻咽癌中碱性成纤维细胞生长因子的实验研究

陈广理1，龚树生2，陈 沛3，罗凌惠3

目的研究碱性成纤维细胞生长因子在鼻咽癌中的表达，探讨它与鼻咽癌的增生、浸润及转移的关系。方法在26例鼻咽癌及相应癌旁组织和10例正常鼻咽部黏膜组织中，应用RT-PCR和免疫组织化学方法检测碱性成纤维细胞生长因子mRNA和蛋白质的表达。结果碱性成纤维细胞生长因子在鼻咽癌组织中高表达，在正常鼻咽部黏膜中低表达，差异具有统计学意义(P<0.01)。结论碱性成纤维细胞生长因子与鼻咽癌的生长、浸润及转移有密切关系。

鼻咽癌；碱性成纤维细胞生长因子；RT-PCR；免疫组织化学

肿瘤的增生、浸润和转移依赖于新生血管为它提供的氧气和营养物质，而在肿瘤血管生成过程中起重要诱导作用的物质是血管生长因子，它促进肿瘤新生血管的生成[1]。多种诱导血管生成的生长因子已被阐明，其中碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)在肿瘤新生血管生成过程中起着至关重要的作用[2]。研究表明，bFGF在多种肿瘤高表达，与肿瘤的生长、浸润及转移密切相关，在肿瘤中促进肿瘤细胞的增殖与分化，诱导肿瘤新生血管的形成。临床上鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是具有极高浸润和转移能力的肿瘤，为了了解bFGF在鼻咽癌的发生发展过程中的作用，本实验通过RT-PCR和免疫组织化学方法研究bFGF在鼻咽癌中的表达，探讨其与鼻咽癌的生长、浸润及转移的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料鼻咽癌及相应癌旁组织26例，来源于我院鼻咽部活检及手术切除的标本，其中有淋巴结转移的病例19例、无淋巴结转移的病例7例。癌旁组织取自肿瘤边缘5 mm以外区域，为肉眼下癌旁组织；正常鼻咽部黏膜组织10例，来源于鼻咽部正常的手术病人。全部肿瘤组织经病理诊断均为鳞状细胞癌，其中高分化3例、中分化4例、低分化19例。根据肿瘤的生长范围和扩散的程度，按国际抗癌联盟(UICC)(1997)和美国癌症分期联合委员会(AJCC)(2002)TNM分期标准：I期6例(T1N0M0)、II期14例(其中II期A：T2aN0M01例；II期B：T1N1M09例、T2aN1M02例、T2bN0N1M02例)、III期3例(其中T1N2M02例、T2aT2bN1M01例)、IV期3例(其中IV期A：T4N1N2M01例；IV期B：T3N3M01例；IV期C：T4N3M11 例 )。所有肿瘤患者中，男19例，女7例，年龄27～78岁，平均(48.03±5.52)岁，术前均未经化疗或放疗。

1.2 主要试剂和仪器逆转录酶MLV(MBI)，TRIzol试剂(GibCO),dNTP(MBI)，TaqDNA聚合酶(MBI)，bFGF单克隆抗体(美国SIGMA)，二抗体(美国ZYMED)，GDS8000型凝胶成像系统(UVP)，PTC-200 PCR仪(MJA)，Grab-it 4.0分析软件为Gelworks 1D interdiate，DU650型紫外光分光光度仪(BECKMAN)。

1.3 引物设计见表1。

表1 引物序列表

1.4 组织RNA提取和cDNA合成取约50 mg组织放入匀浆器中，加入1 mL TRIzol匀浆，用氯仿和异丙醇逐步提取RNA，溶于焦碳酸二乙脂水中，然后应用紫外分光光度仪检测定量。

1.5 RT-PCR反应以cDNA为模板，扩增β-actin (300 bp)、bFGF (223 bp)等基因片断。目的基因bFGF和内参基因β-actin引物在同一EP管中进行PCR反应。反应体系为25 μL，含上述基因cDNA 2.0 μL，上游和下游引物的终浓度各0.2 μmol/L，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 的终浓度0.2 mmol/L，TaqDNA聚合酶1 U，Mg2+的终浓度2.0 mmol/L。RT-PCR反应条件：95℃预变性5 min，95℃ 1 min、50℃ 1 min、72℃ 1 min，72℃延伸5 min。反应结束后取5 μL产物电泳,用grab-It成像系统照像，然后用分析各条带的积分吸光密度值，以目的基因与β-actin的相对积分吸光密度值记录结果。

1.6 免疫组织化学染色采用SP法作bFGF免疫组织化学染色。 抗bFGF单克隆抗体1∶100稀释，DAB显色液显色，呈棕黄色着色，以正常小鼠血清代替一抗体为阴性对照。实验结果观察：bFGF阳性细胞染色定位于细胞膜、细胞浆和部分细胞核，阳性细胞呈棕黄色着色，每张玻片分别在双目显微镜下放大200倍，随机选取5个视野进行图像分析，分析各张玻片的bFGF的平均吸光密度值。

1.7 统计学分析应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，方法是应用两个独立样本的t检验，分析bFGF mRNA及蛋白质在鼻咽癌与鼻咽部正常黏膜表达的差异，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 在鼻咽癌组织中bFGFmRNA高表达，在正常鼻咽部黏膜中低表达本实验研究表明bFGF mRNA在全部鼻咽癌组织中高表达(图1)，bFGFmRNA在无淋巴结转移的鼻咽癌组织、有淋巴结转移鼻咽癌组织中平均相对吸光度值分别为：0.862±0.039和0.870±0.039，它们二者之间差异无统计学意义(t= 1.394，P>0.05)。bFGF mRNA在鼻咽癌癌旁组织和正常鼻咽部黏膜中低表达(图1)，相对平均吸光度值分别为：0.211±0.033、0.209±0.037。二值差异无统计学意义(t= 1.361，P>0.05)。bFGF mRNA在鼻咽癌组织中的表达与在正常鼻咽部黏膜的表达之间，差异均具有统计学意义(P<0.01)。

M：DL1200 Marker；1～4：无淋巴结转移的鼻咽癌组织、有淋巴结转移鼻咽癌组织、癌旁组织、正常鼻咽部黏膜中的PCR产物(223 bp)。

图1bFGFmRNA在鼻咽癌、癌旁组织和正常鼻咽部黏膜中的表达

2.2 bFGF蛋白质在鼻咽癌组织中高表达，在正常鼻咽部黏膜中低表达bFGF在鼻咽癌组织中高表达，定位于癌细胞的细胞质(图2)，平均吸光度值为：0.325±0.016；在正常鼻咽部黏膜弱表达或不表达(图3)，细胞的平均吸光度值为：0.071±0.011。差异有统计学意义(t=40.173，P<0.01)。

图2 鼻咽癌中bFGF表达(bFGF免疫组化SP×400)

图3 正常鼻咽部黏膜上皮bFGF表达(bFGF免疫组化SP×400)

3 讨论

鼻咽癌为我国最常见的恶性肿瘤之一，多见于我国南方的广东、广西、湖南、福建、江西等省份，男性发病率为女性的2～3倍，40～50岁为高发年龄段。鼻咽癌是极易转移的肿瘤，通常颈淋巴结转移常为患者最早发现的体征，颈部肿块为此病首发症状者约占60%。bFGF是广泛存在于体内多种组织的一类多肽生长因子，对机体细胞有明显的促增殖作用，在机体的血管形成、创伤修复过程中起着重要的调节作用。研究表明，多种肿瘤细胞中bFGF高表达，其与肿瘤的分化、浸润、生长、转移和肿瘤新血管的生成有密切关系[3]。本实验检测表明，bFGF在鼻咽癌组织中均高表达，在癌旁组织和正常鼻咽部黏膜中低表达，它们在鼻咽癌各期组织与在正常喉黏膜的表达之间，差异均具有统计学意义。实验结果表明，鼻咽癌的快速生长、浸润及转移与bFGF的高表达有密切的关系。主要发生机制讨论如下。

肿瘤血管生成是肿瘤生长的前提,其与多种生长因子的刺激有关,其中bFGF是内皮细胞生长促进作用效果最强的因子之一[4]。主要机制是bFGF调节细胞外分子，包括胶原酶、蛋白激酶、整合素等的活性，促进毛细管内皮细胞的分化及毛细管内腔的形成。在肿瘤中新生血管形成以及蛋白激酶和整合素等分子的调节作用，利于肿瘤细胞增殖和向细胞外基质侵袭，促进肿瘤细胞的浸润和转移。多种文献报道，bFGF及其高亲和力受体FGFR在多种肿瘤组织中高表达，如肝癌、食管癌、肺癌等，促进这些肿瘤的发生和发展，bFGF与FGFR结合进一步促进肿瘤的新生血管形成，加速肿瘤细胞的浸润和转移[5]。结合本实验结果，bFGF在鼻咽癌组织中高表达，在癌旁组织和正常鼻咽部黏膜中低表达，表明bFGF促进了鼻咽癌的新生血管生成。

研究表明，bFGF具有促进细胞分裂和刺激血管生长的作用。在肿瘤组织中bFGF高表达及基因活性增强，促进肿瘤血管新生，增加肿瘤组织的血液供应，从而为肿瘤细胞快速增殖提供氧和营养物质，进一步促进肿瘤的生长和增殖[6]。结合本实验结果，bFGF在鼻咽癌组织中均高表达，表明bFGF促进了鼻咽癌细胞的增殖。

侵袭与转移是恶性肿瘤最本质的特征，与肿瘤新生血管密切相关，血管形成是肿瘤侵袭的一个重要条件。肿瘤组织一旦有新生血管长入，则肿瘤会呈指数生长并获得转移能力，此时称为肿瘤生长的血管期。血管形成本身就有一定的侵蚀性，肿瘤细胞可以沿着新生血管所开启的胶原裂隙侵蚀。另外肿瘤新生血管仅排列一层内皮细胞，缺乏平滑肌，基膜变薄或缺如，使得新生血管容易被肿瘤细胞穿透，促进肿瘤细胞向远处转移。bFGF促进肿瘤新生血管形成的作用，有利于肿瘤细胞向细胞外基质侵袭，促进肿瘤细胞的浸润和转移[7]。

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ExpressionofBasicFibroblastGrowthFactorinNasopharyngealCarcinomaandItsSignificance

CHEN Guang-li,GONG Shu-sheng,CHEN Pei,et al

(Third Affiliated Hospital,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

ObjectiveTo study the expressions of basic fibroblast growth factor(bFGF) in nasopharyngeal carcinoma(NPC) and its significance.MethodsIn this study,we investigated the expression level of bFGF in twenty-six NPC and tissues adjacent to tumor and ten normal nasopharyngeal mucous membrane using techniques of semi-quantify RT-PCR and immunohistochemistry.ResultsIt was showed that the expression level of bFGF was significantly increased in NPC as compared with the normal nasopharyngeal mucous membrane (P<0.01).ConclusionThese data raise the possibility that bFGF may play key roles in the growth,invasion and metastasis of NPC.

nasopharyngeal carcinoma; bFGF; RT-PCR

2014-03-18

1.河南科技大学第三附属医院洛阳东方医院耳鼻咽喉科，河南洛阳 471003 2.首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科，北京 100730 3.华中科技大学同济医学院附属协和医院耳鼻咽喉科，湖北武汉 430022

陈广理(1971-)，男，河南鄢陵人，副主任医师，从事耳鼻咽喉科基础与临床工作。

R739.63

A

1672-688X(2014)02-0094-03