一测多评法测定青钱柳中异槲皮苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和阿福豆苷的含量

张丁文，刘 悦，解生旭，司云珊，刘云雪，关 欣，徐雅娟*

（1.长春中医药大学，长春 130117;2.吉林省中医药科学院，长春 130012）

一测多评法测定青钱柳中异槲皮苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和阿福豆苷的含量

张丁文1，刘 悦2，解生旭2，司云珊2，刘云雪1，关 欣1，徐雅娟2*

（1.长春中医药大学，长春 130117;2.吉林省中医药科学院，长春 130012）

目的 建立超高效液相色谱法测定青钱柳中异槲皮苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和阿福豆苷含量的一测多评法。方法 以阿福豆苷为内参物，建立阿福豆苷与异槲皮苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷的相对校正因子，并用该校正因子进行异槲皮苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷的含量计算（计算值），实现一测多评;同时采用外标法测定药材中3种黄酮含量（实测值），并比较计算值与实测值的差异。结果经测定异槲皮苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和阿福豆苷在药材中的含量分别为1.403，1.314，1.633 mg/g;5批青钱柳药材中3种异黄酮的含量计算值与实测值间无统计学意义。结论 以外标法测定阿福豆苷，利用相对校正因子实现对异槲皮苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷含量进行质量评价准确、可行。

青钱柳;含量测定;黄酮苷;超高效液相色谱

青钱柳（Cyclocarya paliurus（Batal.）Ijinakaja）又名青钱李（江西）［1］，系青钱柳属（Cyclocarya Ijinsk）落叶乔木［2］。因其叶甘甜滋润，民间常作甜茶饮［3-4］。研究［5-10］表明，黄酮类成分是青钱柳相关文献报道中最多的一类成分，含量很高，也是青钱柳中重要的活性成分，该类成分在人类饮食结构中的摄入量与心脑血管等疾病的发生有着密切的关系。因此，着力控制青钱柳药材的质量问题势在必行。本实验首次应用一测多评法（Quantitative Analysis of Multi-Components By Single Marker，QAMS）［11］对青钱柳中3种黄酮成分进行了含量测定，为青钱柳药材的质量控制和进一步开发利用奠定了基础。

1 仪器与试药

Agilent1200超高效液相色谱仪;青钱柳干燥叶购自江西省九江市修水县，由吉林省中医药科学院徐国经老师鉴定;阿福豆苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷、异槲皮苷对照品均为实验室自制;乙腈（色谱纯）;乙酸（分析纯）;水为二次蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 AgilentXDB-C18柱（1.8 μm，4.6 mm×50 mm）;流动相:A为H2O∶HOAc=98∶2，（2%乙酸pH为3.0）。流动相B为CH3CN，洗脱程序为:0～5min，20%B ～24%B;5 ～10 min，24%B ～30%B;10 ～12 min，30%B ～60%B，梯度洗脱;流速:0.4 mL/min;柱温:25℃;进样量:6.0 μL;检测波长:360 nm。

2.2 对照品溶液的制备 精密称定异槲皮苷4.94 mg，槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷 4.93 mg，阿福豆苷4.92 mg，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得，保存于4℃冰箱，备用。

2.3 供试品溶液的制备 取青钱柳干燥叶2.5 g，粉碎后置圆底烧瓶中，精密加入石油醚（60～90℃）75 mL，加热回流提取1h，弃去提取液并挥至无醚味，加入75 mL甲醇加热回流2次，每次1 h，合并提取液，加入75 mL乙酸乙酯萃取3次，萃取液合并后蒸干，用甲醇溶解后转移至25 mL容量瓶中，并定容至刻度，摇匀，即得，保存于4℃冰箱，备用。

2.4 线性范围 分别精密吸取浓度为0.197 6，0.197 2，0.196 8 mg/mL的异槲皮苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷、阿福豆苷对照品溶液 2，4，6，8，10 μL 注入液相色谱仪，测定其峰面积，以进样量（X，μg）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制各成分的线性关系曲线。

2.5 精密度实验 精密吸取2.2项下对照品溶液6 μL，重复5次进样，测定峰面积，计算，3种黄酮成分峰面积平均值分别为6 194.7，4 959.6，4 549.2，RSD分别为0.69%，0.78%，0.75%。

2.6 重现性实验 分别取青钱柳干燥叶粉碎2.5 g，共6分，精密称定，按2.3项下的供试品制备方法制备，测定3种黄酮成分平均含量为1.403，1.314，1.633 mg/g，RSD 分别为2.55%，2.02%，2.52%（n=6）。

2.7 稳定性实验 精密吸取2.3项下的供试品溶液6 μL，分别放置 0，2，4，6，8，10 h 后进样，测定峰面积，计算，3种黄酮成分峰面积平均值分别为 4 653.0，3 850.8，3 884.6，RSD 分 别 为 0.95%，1.08%，2.10%。

2.8 加样回收率试验 取已知含量的青钱柳药材干燥叶约1.25 g，精密称定，平行6分，分别按样品含量与对照品（1∶1）的比例加入一定量的对照品混合溶液，按2.3项下的方法进行制备。测定，计算上述3种黄酮成分加样回收率分别为102.54%，99.43%和100.28%，RSD分别为2.06%，4.00%，3.08%。

2.9 相对校正因子的建立

2.9.1 相对校正因子的测定 取2.2项下的对照品混合溶液，进样 2，4，6，8，10 μL，测定峰面积，分别计算待测组分与内参物阿福豆苷间的相对校正因子，结果fⅡ/fⅣ平均值为1.358 8、fⅡ/fⅤ平均值为 1.091 2;RSD分别为1.29%，0.82%。

2.9.2 相对校正因子的重复性试验 按照2.2项下的方法，配制对照品的混合溶液平均4分，分别进样6 μL，测定3种黄酮成分的峰面积值。分别计算待测组分与内参物间的相对校正因子，fⅡ/fⅣ平均值为1.354 7，fⅡ/fⅤ平均值为 1.088 4;RSD分别为0.04%，0.02%。

2.9.3 相对校正因子的耐用性考察

2.9.3.1 不同色谱柱对相对校正因子的影响 试验中采用Agilent 1200超高效液相色谱仪分别考察了Agilent XDB-C18柱（1.8 μm，4.6 mm ×50 mm）及 Agilent SB-C18柱（1.8 μm，4.6 mm ×50 mm）2 种不同型号的色谱柱对相对校正因子的影响，测得，AgilentSB-C18柱 fⅡ/fⅣ为 1.412 0，fⅡ/fⅤ为 1.137 2，AgilentXDB-C18柱 fⅡ/fⅣ为 1.352 4，fⅡ/fⅤ为 1.079 6;RSD 分别为3.45%，3.68%。

2.9.3.2 不同温度对相对校正因子的影响 试验中采用Agilent1200超高效液相色谱系统，AgilentXDBC18柱（1.8 μm，4.6 mm ×50 mm）色谱柱，在不同柱温（25，30，35℃）条件下对相对校正因子进行测定，测得，25 ℃fⅡ/fⅣ为 1.352 4，fⅡ/fⅤ为 1.079 6;30 ℃fⅡ/fⅣ为 1.341 3，fⅡ/fⅤ为1.072 3;35 ℃fⅡ/fⅣ为1.351 8，fⅡ/fⅤ为1.094 6;2种校正因子的RSD分别为0.46%，1.05%。

2.9.3.3 不同流速对相对校正因子的影响 试验中采用Agilent 1200超高效液相色谱系统，AgilentXDBC18柱（1.8 μm，4.6 mm ×50 mm）色谱柱，在不同流速（0.3，0.4，0.5 mL/min）条件下对相对校正因子进行测定，测得，0.3 mL/min fⅡ/fⅣ为 1.355 9，fⅡ/fⅤ为 1.090 7;0.4 mL/minfⅡ/fⅣ为 1.352 4，fⅡ/fⅤ为 1.079 6;0.5 mL/minfⅡ/fⅣ为 1.341 3，fⅡ/fⅤ为 1.072 2;2 种校正因子的RSD分别为0.56%，0.86%。

2.9.3.4 不同修饰剂对相对校正因子的影响 试验中采用Agilent 1200超高效液相色谱系统，AgilentXDB-C18柱（1.8 μm，4.6 mm ×50 mm）色谱柱，考察了流动相中加入不同的修饰剂对相对校正因子的影响，测得，2% 乙酸 fⅡ/fⅣ为 1.352 4，fⅡ/fⅤ为 1.079 6;2% 甲酸 fⅡ/fⅣ为1.357 4，fⅡ/fⅤ为1.091 5;2 种校正因子的RSD分别为0.26%，0.78%。

2.9.4 相对校正因子的确定 根据实验取测定结果的平均值，最终确定的3种成分间的相对校正因子分别为:f360nmⅡ/Ⅳ =1.355 2;f360nmⅡ/Ⅴ =1.099 8。

3 待测成分色谱峰定位参数考察

“一测多评”法应用的前提是如何将色谱峰准确定位。本实验分别考察了采用不同进样量和不同型号色谱柱时待测成分与阿福豆苷色谱峰间的相对保留时间和保留时间差。结果表明，采用AgilentXDBC18柱不同进样量时RSD分别为1.93%、0.93%，采用AgilentSB-C18柱不同进样量时RSD分别为0.97%、0.48%，采用不同色谱柱时异槲皮苷和槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷与阿福豆苷相对保留时间RSD分别为0.66%、0.32%，采用不同进样量、不同色谱柱保留时间差的RSD也均小于5%。可见，与阿福豆苷色谱峰间的相对保留时间和保留时间差可作为其他2个待测成分色谱峰的定位参数。

4 数据比较

首先，应用ESM法对5批青钱柳药材中3种待测成分进行多成分的同步测定，再用建立的QAMS法对待测成分进行定位，并计算含量，最后将二者得到的结果以相对误差进行评价。结果表明，二者所得结果无显著性差异，相对误差＜5%，表明建立的青钱柳QAMS质量评价模式具有较好的准确性与可行性。结果见表2。

表2 QAMS与ESM测得的青钱柳药材中3种黄酮类成分含量

5 结论

实验选用甲醇作为提取溶剂，并用乙酸乙酯萃取的方法，目标成分提取效率最高，较易操作，且干扰峰较少。流动相中加入乙酸可以改善分离效果，使峰形更尖锐、对称，防止拖尾。

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［1］谢明勇，李磊.青钱柳化学成分和生物活性研究概况［J］.中草药，2001，32（4）:79-80.

［2］中国科学院院中国植物志编辑委员会.中国植物志［M］.北京:科学出版社，1979.

［3］曾美玉，曾建飞.中国中药资源志要［M］.北京:科学出版社，1994.

［4］谢国文.神茶-青钱柳［J］.植物杂志，1999（1）:16.

［5］麻景梅，宋新波，张丽娟，等.荒漠肉苁蓉多糖的研究［J］.吉林中医药，2012，32（2）:199-201.

［6］张晓瑢，廖循，丁立生.青钱柳的化学成分［J］.应用与环境生物学报，2001，7（1）:90-91.

［7］欧晓阳，许闪闪，袁强.湖州地区蝉花中小极性组分的气质联用分析［J］.长春中医药大学学报，2013，29（6）:1123.

［8］孙荣斌，程宝荣，武露凌.赤芍中脂溶性成分GC/MS联用分析［J］.长春中医药大学学报，2010，26（2）:283-284.

［9］李磊，谢明勇，孙振华，等.保健食品青钱柳中稀土元素的组成及溶出特性［J］.中国畜产与食品，2005，7（3）:101-102.

［10］Vinson J A，Dabbagh Y A，Serry M M，et al.Plant flavonoids，especially tea flavonols，are powerful antioxidants using an in vitro oxidation model for heart disease［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1995，43（11）:2800-2802.

［11］王智民，高慧敏，付雪涛，等.“一测多评”法中药质量评价模式方法学研究［J］.中国中药杂志，2006，31（23）:1925-1928.

Determination of the content of isoquercitrin，quercetin-3-O-α-L-rhamnoside and asafzelin of cyclocarya paliurus by QAMS

ZHANG Dingwen1，LIU Yue2，XIE Shengxu2，SI Yunshan2，LIU Yunxue1，GUAN Xin1，XU Yajuan2*
（1.Changchun University of Traditional Chinese Medicine，Changchun 130117，China;2.Jilin Academy of Chinese Medicine Sciences，Changchun 130012，China）

ObjectiveTo establish UPLC method for the determination of isoquercitrin，quercetin-3-O-α-L-rhamnoside and asafzelin in Cyclocarya paliurus by QAMS.MethodsAsafzelin was used as an internal materials，the relative correction factor between asafzelin，isoquercitrin and quercetin-3-O-α-L-rhamnoside was established，And these correction factors were used to calculate the determination of isoquercitrin，quercetin（calculated value）to achieve QAMS;at the same time，the determination of 3 kind of flavonoids in herbs（measured value）was measured by the external standard method.ResultsThrough determination，the content of isoquercitrin，quercetin-3-O-α-L-rhamnoside and asafzelin was 1.403 mg/g，1.314 mg/g，1.633 mg/g respectively;the calculated value of the content of 3 isoflavonoids in 5 batches of cyclocarya paliurus medicinal materials had no significant difference with measured value.ConclusionIt was correct and feasible to determinate asafzelin by ESM，and conduct quality evaluation of the content of isoquercitrin and quercetin-3-O-α-L-rhamnoside by using the relative correction factors.

cyclocarya paliurus;determination;flavonoid glycosides;ultra performance liquid chromatography

R284.2

A

2095－6258（2014）05－0810－03

10.13463/j.cnki.cczyy.2014.05.018

科技部重大创制药物专项（2009ZX09103-447）。

张丁文（1988－），女，硕士研究生。研究方向:药物活性物质分析与结构研究。

徐雅娟，电话:0431-86058690，电子信箱:1045758849@qq.com。

2014－05－19）