铁皮石斛不同阶段多糖和甘露糖含量研究

魏欢平+李翠+罗罡+张思思+林星贝+贺筱蓉

摘 要：以软脚红杆铁皮石斛为实验材料，参考《中国药典》（I部）标准，对其原球茎、丛生芽、瓶苗茎、炼苗茎和鲜条进行多糖和甘露糖含量的检测。结果表明：（1）软脚红杆铁皮石斛不同阶段多糖和甘露糖含量都达到了中国药典的标准。（2）软脚红杆铁皮石斛植株在不同生长阶段，多糖和甘露糖含量差异较小。（3）人工组培的石斛不同阶段中，都含有丰富的多糖和甘露糖，具有较高的营养价值；原球茎与鲜条的多糖和甘露糖含量差异虽然不大，但与鲜条相比，具有生长时间短、简单易得等优势。（4）在当今野生铁皮石斛紧缺的情况下，通过组培方式获得的铁皮石斛原球茎和丛生芽，可以弥补野生铁皮石斛资源不足的问题。

关键词：铁皮石斛；不同阶段；多糖；甘露糖

中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）20-29-03

Study on the Polysaccharide and Mannose Content of Dendrobium officinale at Different Stages

Wei Huanping et al.

（Science and Technology of Institute，Zhejiang International Studies University，Hangzhou 310012，China）

Abstract：With soft feet red bar Dendrobium officinale as experiment material，referring to the Chinese pharmacopoeia I standard，we test the contents of polysaccharide and mannose of the soft feet red bar Dendrobium officinale protocorm，multiple shoot clumps，Container seedlings stem，refined seedling stem and article fresh. The results show that：（1）polysaccharide and mannose content of soft foot red bar Dendrobium officinale at different stages all reach the standard of Chinese pharmacopoeia.（2）difference among soft foot red bar Dendrobium officinale plant polysaccharide and mannose content in the different stages of growth is small.（3）Dendrobium officinale from tissue culture at different stages all contain abundant polysaccharide and mannose with high nutritional value. Especially，the difference between the content of polysaccharide and mannose in Dendrobium officinale protocorm and fresh is not big. But compared with fresh article，it has the advantages of simple and easy with a short growth time.（4）In today's situation of shortage of wild Dendrobium officinale，protocorm and multiple shoot clumps of Dendrobium officinale from tissue culture can make up for the deficiency of wild Dendrobium officinale resources.

Key words：Dendrobium officinale；Different stages；Polysaccharide；Mannose

1 引言

铁皮石斛（Dendr0bium 0fficinale Kimura et Migo），俗称铁皮枫斗，是被中国药典收载的5种石斛属植物之一，为常用名贵中药[1]，其有效成分为石斛多糖[2]。华允芬、吕洪飞等人比较了石斛属的多种植物，发现多糖是铁皮石斛的特征性成分[3-6]。李彩霞、竹剑平在不同采收期铁皮石斛多糖含量比较研究中提到，铁皮石斛采摘以冬季为最佳[7]。甘露糖是目前唯一用于临床上的糖质营养素，广泛分布于体液和组织中，尤其是在神经、皮肤、睾丸、视网膜、肝和肠[8]。龚庆芳等在不同产地铁皮石斛的品质比较研究中提到，不同产地的铁皮石斛多糖和甘露糖的含量差异显著，一般在18.00%～32.35%[9]，其中采自云南、浙江的种质在多糖和甘露糖方面有着优良的遗传基础。

目前对铁皮石斛不同阶段（原球茎、丛生芽、瓶苗茎、炼苗茎、鲜条）多糖和甘露糖的含量的研究并没有涉及。为此，笔者按照《中国药典》（I部）的标准中铁皮石斛多糖和甘露糖含量测定的方法。对实验室铁皮石斛不同阶段多糖和甘露糖含量进行检测，以期为铁皮石斛进一步开发利用提供科学依据。

2 材料与方法

2.1 实验材料 本实验采用的材料为软脚红杆铁皮石斛的原球茎、丛生芽、瓶苗茎、炼苗茎和鲜条。原球茎、丛生芽和瓶苗茎为在1/2MS固体培养基中培养所得；炼苗茎为铁皮石斛瓶苗炼苗1a后所得；鲜条为铁皮石斛成品新鲜茎条。endprint

2.2 实验方法

2.2.1 铁皮石斛多糖含量检测 取待检测粉末约0.3g，加水200mL，加热回流2h，定容至250mL；精密量取2mL，加入无水乙醇10mL，冷藏1h，离心（转速为4 000r/min）20min，沉淀加80%乙醇洗涤2次，沉淀加热水溶解，定容至25mL备用。取供试品溶液1mL，加入5%苯酚溶液1mL、硫酸5mL，置沸水浴中加热20min，取出，置冰浴中冷却5min，在488nm的波长处测定吸光度。供试品溶液中无水葡萄糖含量为：葡萄糖含量（%）=C×V总×D/（W×V测×106）×100。

式中，C：在标准曲线上查出的葡萄糖含量；V总：提取液总体积；V测：测定时取用的体积；D：稀释倍数；W：样品重量（g）。

2.2.2 铁皮石斛甘露糖检测方法

2.2.2.1 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.02mol/L的乙酸铵溶液（20∶80）为流动相；检测波长为250nm。

2.2.2.2 铁皮石斛甘露糖含量测定方法 取待检粉末约0.12g，置索氏提取器中，加80%乙醇适量，加热回流提取4h，弃乙醇液，加水100mL，煎煮1h放冷，离心，吸取上清液1mL，置安瓿瓶或顶空瓶中，加3.0mol/L的盐酸溶液0.5mL，封口，110℃水解1h，用氢氧化钠溶液调节pH值至中性，吸取400μL，加0.5mol/L的PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）甲醇溶液200μL与0.3mol/L的氢氧化钠溶液400μL，70℃水浴反应100min。再加0.3mol/L的盐酸溶液500μL，用三氯甲烷洗涤3次，取上清液10μL，注入液相色谱仪测定。供试品溶液中无水甘露糖含量为：甘露糖含量（%）=CR×V×D/（W×106）×100。

式中，CR：对照品浓度；V：在标准曲线上查出的相对甘露糖溶液体积；D：稀释倍数；W：样品重量（g）。

3 结果与分析

3.1 铁皮石斛不同阶段多糖含量的比较

3.1.1 葡萄糖浓度与吸光度的线性关系考察 以吸光度值为纵坐标（Y），以葡萄糖浓度为横坐标（X），绘制标准曲线图并得到回归方程：y=5.708x-0.0160。

3.1.2 铁皮石斛不同阶段多糖含量分析 从图1可知，铁皮石斛不同阶段多糖含量在26.581 4%～36.459 6%，其中瓶苗茎中多糖的含量最高，为36.459 6%；其次为炼苗茎，多糖含量为29.542 8%；再次为丛生芽和鲜条，多糖含量分别为27.662 1%和26.959 2%；原球茎中多糖含量相对其他阶段较低，为26.581 4%。按照《中国药典》的标准，铁皮石斛按干燥品算，含铁皮石斛多糖以无水葡萄糖（C6H12O6）计不少于25.00%。本次实验结果说明，铁皮石斛不同阶段的多糖含量都达到并超过《中国药典》标准中的要求；同时也说明软脚红杆铁皮石斛植株中的多糖含量在不同生长阶段差异较小。

从图1还可以看出，固体培养基培养的原球茎多糖含量略低于其他阶段的多糖含量，而固体培养的原球茎多糖含量与铁皮石斛鲜条多糖含量相当。高建平等[10]通过免疫药理的研究发现，铁皮石斛原球茎与原药材作用相似，能提高机体的非特异性免疫功能和细胞免疫功能。何铁光等[11]通过对铁皮石斛不同来源材料的主要药用成分多糖和氨基酸含量进行比较，结果表明，铁皮石斛不同来源材料的多糖含量不同，原球茎与野生品的多糖和总氨基酸含量相近，初步证明以组织培养获得的铁皮石斛原球茎代替其野生品是解决铁皮石斛资源紧缺的有效途径。因此，对于铁皮石斛固体培养基不同阶段培养物有效成分的研究，值得进一步深入探讨。

<＼＼Pc10＼文档 （E）＼姜秀红＼杂志＼安徽农学通报杂志＼2014-20农学通报内文＼w294-1.tif> [多糖含量（%）][生长阶段]

图1 铁皮石斛不同阶段多糖含量

3.2 铁皮石斛不同阶段甘露糖含量的比较 在采用内标法测定铁皮石斛不同阶段甘露糖的含量时，由于内标物的峰在HPLC图谱没有出现而不能计算校正因子，进而采用外标法测定铁皮石斛不同阶段甘露糖的含量。

3.2.1 甘露糖浓度与峰值的线性关系考察 以甘露糖浓度为纵坐标（Y），以液相色谱峰高为横坐标（X），绘制标准曲线图并得到回归方程：y=5.8743x+651.73。

3.2.2 铁皮石斛不同阶段甘露糖含量分析 从图2可知，瓶苗茎中甘露糖的含量最高，为32.414%；鲜条甘露糖含量为28.775%；炼苗茎、丛生芽和原球茎的甘露糖含量分别为24.051%、23.853%和22.946%。按照《中国药典》的标准，铁皮石斛按干燥品算，甘露糖（C6H12O6）含量为13.0%～38.0%。本次试验结果表明，铁皮石斛不同阶段甘露糖的含量均达到《中国药典》的标准；同时说明铁皮石斛从人工培养的初始阶段就已经开始了次生代谢产物的生产，而且也有一定的药用价值，这也是目前采用固体培养基生产和提取石斛甘露糖的一个主要依据。

<＼＼Pc10＼文档 （E）＼姜秀红＼杂志＼安徽农学通报杂志＼2014-20农学通报内文＼w294-2.tif> [甘露糖含量（%）][生长阶段]

图2 铁皮石斛不同阶段甘露糖含量

4 结论与讨论

（1）由本次试验结果可知，铁皮石解不同阶段的多糖和甘露糖含量均达到并明显高于《中国药典》（I部）标准，其中瓶苗茎的多糖含量和甘露糖含量都高于铁皮石斛其他阶段的多糖和甘露糖含量。但是铁皮石斛不同阶段多糖和甘露糖含量有一定的差异，说明软脚红杆铁皮石斛植株中的多糖和甘露糖含量随取材时间不同，差异还是较大的。

（2）目前铁皮石斛鲜条主要通过大棚植培的方式得到，前期利用培养基促进种子萌发，经过6～9个月的时间获得组培苗，再经过1a的炼苗将铁皮石斛幼苗移栽到基质中，进行大棚种植，种植后的第3年秋冬开始收获石斛鲜条。以植培生长模式代替野生生长是近年来解决珍稀中药材的有效途径之一，相对于野生生长，植培具有以下优势：一是易控温控湿，栽培过程中可以通过人工逐步调整并解决其生长的基本条件；二是种植过程方便控制、应用较广、产量较高。而植培的劣势则在于：一是种植时间长，存活率低；二是大棚种植占地面积大，会在一定程度上造成土地资源浪费；三是铁皮石斛对其生长环境要求苛刻，在种植过程中遇到高温、冰冻或连续降雨等极端天气都有可能对铁皮石斛的种植造成重大损失。endprint

（3）相对于鲜条，原球茎和丛生芽的获取更为简单易得，并且原球茎和丛生芽一旦获取，我们可以利用其增殖的特点获取大量的原球茎和丛生芽，并直接从原球茎和丛生芽获取多糖等有效成分，大大节省了时间和成本。

（4）与原药材相比，组培物是否具有同样的药用价值是必须考虑的。本研究结果发现，固体培养基培养得到的铁皮石斛在不同阶段与铁皮石斛原药材的多糖和甘露糖含量相当，人工组培的铁皮石斛不同阶段都含有丰富的多糖和甘露糖，具有较高的营养价值。铁皮石斛原球茎与鲜条的多糖含量差异不大，但与鲜条相比，具有生长时间短、简单易得等特点。在当今野生铁皮石斛紧缺的情况下，通过组培方式获得的铁皮石斛可以弥补野生铁皮石斛资源不足的问题。

参考文献

[1]中华人民共和国卫生部药典委员会.中国药典（I部）[M].北京：化学工业出版社，2000：70.

[2]马继光.神农本草经辑注[M].北京：人民卫生出版社，1995：76.

[3]华允芬，陈云龙，张铭.三种药用石斛多糖成分的比较研究[J].浙江大学学报：工学版，2004，38（2）：249-252.

[4]吕洪飞，郭卫东，罗文姬，等.2种石斛属植物和小叶石仙桃多糖的组织化学定位[J].中山大学学报：自然科学版，2007，46（3）：79-83.

[5]赵俊凌，马洁，段立胜.西双版纳地区铁皮石斛及齿瓣石斛品质的初步研究[J].时珍国医国药，2009，20（12）：2944-2946.

[6]白音.药用石斛鉴定方法的系统研究[D].北京：北京中医药大学，2007.

[7]李彩霞，竹剑平.不同采收期铁皮石斛中多糖含量比较[J].药物分析杂志，2010，30（6）.

[8]罗慧玲，蔡体育，陈巧伦，等.石斛多糖增强脐带血和肿瘤病人外周血LAK细胞体外杀伤作用的研究[J].癌症，2000，19（12）：1124-1126.

[9]龚庆芳，周浩，王新桂，等.不同产地铁皮石斛的品质比较研究[J].北方园艺，2013（08）：162-165.

[10]高建平，金若敏，吴耀平，等.铁皮石斛原球茎与原药材免疫调节作用的比较研究[J].中药材，2002，25（7）：487-489.

[11]何铁光，苏江，王灿琴，等.铁皮石斛不同来源材料多糖和氨基酸含量的比较[J].广西农业科学，2007，38（1）：322341

（责编：张宏民）endprint

（3）相对于鲜条，原球茎和丛生芽的获取更为简单易得，并且原球茎和丛生芽一旦获取，我们可以利用其增殖的特点获取大量的原球茎和丛生芽，并直接从原球茎和丛生芽获取多糖等有效成分，大大节省了时间和成本。

（4）与原药材相比，组培物是否具有同样的药用价值是必须考虑的。本研究结果发现，固体培养基培养得到的铁皮石斛在不同阶段与铁皮石斛原药材的多糖和甘露糖含量相当，人工组培的铁皮石斛不同阶段都含有丰富的多糖和甘露糖，具有较高的营养价值。铁皮石斛原球茎与鲜条的多糖含量差异不大，但与鲜条相比，具有生长时间短、简单易得等特点。在当今野生铁皮石斛紧缺的情况下，通过组培方式获得的铁皮石斛可以弥补野生铁皮石斛资源不足的问题。

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[11]何铁光，苏江，王灿琴，等.铁皮石斛不同来源材料多糖和氨基酸含量的比较[J].广西农业科学，2007，38（1）：322341

（责编：张宏民）endprint

（3）相对于鲜条，原球茎和丛生芽的获取更为简单易得，并且原球茎和丛生芽一旦获取，我们可以利用其增殖的特点获取大量的原球茎和丛生芽，并直接从原球茎和丛生芽获取多糖等有效成分，大大节省了时间和成本。

（4）与原药材相比，组培物是否具有同样的药用价值是必须考虑的。本研究结果发现，固体培养基培养得到的铁皮石斛在不同阶段与铁皮石斛原药材的多糖和甘露糖含量相当，人工组培的铁皮石斛不同阶段都含有丰富的多糖和甘露糖，具有较高的营养价值。铁皮石斛原球茎与鲜条的多糖含量差异不大，但与鲜条相比，具有生长时间短、简单易得等特点。在当今野生铁皮石斛紧缺的情况下，通过组培方式获得的铁皮石斛可以弥补野生铁皮石斛资源不足的问题。

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[11]何铁光，苏江，王灿琴，等.铁皮石斛不同来源材料多糖和氨基酸含量的比较[J].广西农业科学，2007，38（1）：322341

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