2个不同来源真姬菇子实体同源性的分子鉴定*

黄龙花，夏凤娜，邵满超，张一帆，陈多扬，胡惠萍＊＊

(1.广东省微生物研究所，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东省微生物应用新技术公共实验室，

广东省华南应用微生物重点实验室，广东 广州 510070;2.广东粤微食用菌技术有限公司，广东 广州 510070)

真姬菇Hypsizygus marmoreus(PK)Sing.属于担子菌亚门、伞菌目、白蘑科、玉蕈属[1]，又名斑玉蕈、蟹味菇、玉蕈、假松茸、灵芝菇等，是北温带一种品质优良的食用菌[2]。真姬菇营养价值较高，是1种具有良好保健功能的食用菌，其子实体热水和有机溶剂 (甲醇和乙醇等)提取物，具有清除体内自由基、降血压、提高免疫力和延缓衰老等功效[3]。在日本有“香在松口蘑，味在玉蕈”之称。由于我国真姬菇品种名称使用不规范，造成同种异名、同名异种现象较多，给真姬菇品种交流和产品出口带来不便[4]。因此建立一套准确可靠、稳定性好的真姬菇菌株分类鉴定方法迫在眉睫。

本研究将ERIC－PCR指纹图谱分析和ITS序列分析相结合，对2个不同企业提供的真姬菇子实体进行同源性研究，为快速准确鉴定真姬菇品种提供参考。其中利用ERIC－PCR技术对真姬菇进行同源性分析在国内外尚属首次。

1 材料与方法

1.1 材料

2个供试真姬菇子实体样品，由广东省食用菌行业协会会员单位提供，具体见表1。

表1 供试菇品

1.2 子实体前处理

对获得的子实体进行实地拍照记录，并将新鲜子实体在恒温鼓风干燥箱中50℃烘干，保存备用。

1.3 子实体基因组DNA的提取

子实体总DNA的提取纯化按黄龙花等[5]的方法进行。

1.4 PCR扩增

1.4.1 ERIC－PCR

采用ERIC－PCR通用引物ERIC2和ERICR(ERIC2:5'－ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C－3';ERICR:5'－AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G－3')进行PCR扩增，引物由上海生工合成，扩增在Biometra PCR仪上进行。反应体系为2 ×PCR Taqmix 12.5 μL，DNA 模板 (浓度适中)2.5 μL，ddH2O 6 μL，引物 (10 μmol·L－1)各 2 μL，总体积 25 μL。反应条件为95℃反应5 min;94℃反应1 min，40℃～60℃(温度梯度)反应1 min，72℃反应2 min，30个循环;72℃反应8 min。

1.4.2 ITS－PCR

采用真菌核糖体基因间隔区通用引物 ITS1和 ITS4[6](ITS1:TCC GTA GGT GAA CCT GCG G;ITS4:TCC TCC GCT TAT TGA TA TGC)进行PCR扩增，引物由Sangon公司合成，扩增在Biometra PCR仪上进行。反应体系为2×PCR Taqmix 25 μL，DNA 模板 (浓度适中)5 μL，ddH2O 12 μL，引物(10 μmol·L－1)各 4 μL，总体积 50 μL。反应条件为 94℃反应5 min;94℃反应1 min，55℃反应1 min，72℃反应1 min，30个循环;72℃反应10 min。

1.5 电泳成像及测序

对ERIC－PCR及ITS－PCR产物进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳，在UVP凝胶成像系统 (GE公司)下成像保存。ITS－PCR产物回收纯化后，以扩增引物为测序引物进行双向测序拼接，由华大基因完成。

1.6 图谱分析及序列比对分析

对电泳指纹图谱进行分析 (样品多的情况下，需要用UVIband等软件构建系统进化树，进行进化关系分析);对测得碱基序列，应用Clustal X进行序列完全比对分析 (样品多的情况下，需要进一步用MEGA等软件构建系统进化树，进行进化关系分析)。

2 结果与分析

A公司灵芝菇子实体、B公司真姬菇子实体特征见图1、图2。

由图1、图2可以看出，2种鲜菇子实体外观差异极小，难以区分 (色差由拍照引起)。观察发现，A公司灵芝菇整体较为矮胖，纤维感较强，因而提取DNA时，干燥子实体较难磨碎。对照1和对照2是由同一菌种分离出的不同菌株，结果见图3。

从图3可以看出，退火温度为45℃和48℃时，条带多态性更为丰富，说明这些菌种的ERIC－PCR最佳退火温度为(45±5)℃，其中对照1和对照2的指纹图谱极相近，为同一品系的菌种 (图4进一步验证);而A公司灵芝菇和B公司真姬菇的指纹图谱则差异比较大，应该不是同一品系 (图4进一步验证)。为探索最适退火温度，进一步进行40℃～55℃退火温度的梯度PCR，结果见图4。

由图4可以看出，对照1和对照2在同一退火温度下的ERIC－PCR指纹图谱一致，应为同一品种，其子实体应栽培自同一品种的同一品系;而A公司灵芝菇和B公司真姬菇在同一退火温度下的ERIC－PCR指纹图谱差异明显，可能为不同品种或者同一品种的不同品系。真姬菇ITS序列完全比对图见图5。

由图5可以看出，测序所得的A公司灵芝菇和B公司真姬菇的ITS序列长度均为661 bp，对661个碱基进行完全比对，结果发现它们存在3个碱基差异，其中有1个落在ITS1上;2个在ITS2上。将序列在NCBI的GenBank上作Blast，发现2个序列和GenBank上的已知真姬菇 (Hypsizigus marmoreus)序列相似性均达99%，所以2个均为真姬菇，但应来自不同品系。

3 结论

ERIC－PCR指纹图谱分析和ITS序列分析相结合，对A公司灵芝菇和B公司真姬菇2组外观相近的菇品子实体进行同源性研究。结果发现，A公司灵芝菇和B公司真姬菇的ERIC－PCR指纹图谱存在较大的多态性差异，它们应属于不同菌株 (品系)，甚至不同品种;ITS序列测定结果显示它们仅存在3个碱基差异，应属于同一品种。因此2种分子方法结合分析表明，这两个子实体样品均属于真姬菇 (Hypsizigus marmoreus)品种，来自同一个品种的不同亚种/菌株 (品系)，它们拥有各自独立知识产权。

[1]黄年来.中国大型真菌原色图鉴[M].北京:中国农业出版社，1998.

[2]杨新美.食用菌栽培学[M].北京:农业出版社，1986.

[3]孙培龙，魏红福，杨开，等.真姬菇研究进展 [J].食品科技，2005，26(9):54－57.

[4]王波.几种食用菌品种名称订正 [J].中国食用菌，2006，25(5):27－28.

[5]黄龙花，吴清平，杨小兵，等.基于ITS序列分析探讨我国栽培风尾菇的分类地位 [J].食用菌学报，2009，16(2):30－35.

[6]White TJ，Bruns T，Lee S.Analysis of phylogenetic relationships by amplification and direct sequencing of ribosomal RNA genes[C].//Innis MA.Ed.PCR Protocols:A guide to methods and applications.New York:Academic，1990:15－22.