攀枝花块菌菌根苗培育及显微结构研究*

柳成益，杨 梅，唐 平＊＊，李小林，肖玉军，郑林用，王 云

(1.攀枝花市农林科学研究院，四川 攀枝花 617061;2.四川省农业科学院，四川 成都 610066;3.新西兰皇家植物和食品研究所，新西兰 基督城 8140)

块菌隶属子囊菌亚门 (Ascomycotina)、块菌目 (Tuberales)、块菌科 (Tuberaceae)、块菌属 (Tuber)，子囊果呈不规则的球形、半球形或块状[1]，是世界上最珍贵的可食用菌根菌之一，具有奇特的香味和营养价值，必须与适宜树木营共生生活，因此产量有限，国际市场上价格昂贵，供不应求，其中又以被誉为“黑钻石”的黑孢块菌 (Tuber melanosporum)和意大利白块菌 (Tuber magnatum)最为昂贵[2]。

攀枝花块菌 (T.panzhihuanense)子实体硕大[3]，单个重最大达到453 g，有清香味、肉质细腻、口感较好，在云南松 (Pinus yunnanensis)林下产量大，是2010年到现在为止国内发现具有较大商业潜力的唯一1个白色块菌新种，极具商业价值。3 cm以上国内市场价格在1 500元·kg－1～2 000元·kg－1，远高于印度块菌(500 元·kg－1～800元·kg－1)，攀枝花块菌产量比较有限，市场供不应求。为了能够提高攀枝花块菌产量，丰富国内商业块菌种类，有效保护现有资源，实现持续利用的目的，项目组成功培育出攀枝花块菌菌根苗，采用形态学及分子生物学的方法确定了攀枝花块菌与云南松能形成菌根，并观察了菌根在生长过程中的形态变化，建立了云南松与攀枝花块菌合成的菌根苗的显微检测方法，为实现攀枝花块菌人工栽培奠定了坚实基础，为世界块菌人工栽培技术的突破增加1个新种。攀枝花块菌菌根合成技术未见研究报道，本研究在块菌产业发展上对攀枝花块菌的栽培以及攀枝花块菌宿主植物的筛选有着重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌种

攀枝花块菌:子实体近球形或不规则、多凹凸、坚实、白色、绒毛浓密，直径可达13 cm。有微香味。产孢组织黑灰或浅黑色，有浅白色的弯曲的脉纹。包被单层，由大型细胞和交织的菌丝组成 (图1)。子囊孢子1枚～4枚，近球形至阔椭圆形，成熟时浅黑褐色，网状纹饰。球形至拟球形、梭形、椭圆形或不规则形，无柄或具短柄 (3 μm×4 μm)，壁薄 (1 μm ～2 μm)[3](图 2)。

1.1.2 供试树种和材料

从昆明种子公司购买的云南松 (Pinus yunnanensis)种子，珍珠岩、蛭石、草炭土、钙质土、塑料筐、育苗钵等。

1.2 试验方法

1.2.1 块菌的处理和菌种的制备

块菌成熟季节，在攀枝花市场上购买个头大、外型好、香味浓的块菌作为菌种，经过表面灭菌处理粉碎后与灭菌土按比例混合配置成块菌菌剂[4]。

1.2.2 育苗基质的处理

接种前培育幼苗所用的基质按照珍珠岩∶蛭石=1∶1的比例均匀混合装入布袋中，在121℃～126℃下灭菌2 h。移植和接种苗培育基质按照草炭土∶蛭石∶钙质土=1∶1∶1的比列混合均匀，pH值为6.0～7.0，装入布袋中，在121℃～126℃下高压灭菌2 h。

1.2.3 接种前幼苗培育

云南松种子用清水冲洗干净，再用0.3%的高锰酸钾溶液浸种消毒3 h，清水冲洗干净，放置在相对洁净的房间中，自来水浸种4 d，每天换1次清水。浸种后分别播种在已经灭菌的混合基质的塑料筐中，将塑料筐放置在恒温室中进行培育，发芽1周叶面喷施1次营养液。

1.2.4 块菌接种与管护

接种时选择无菌培育3个月根系发达，苗色较好的幼苗，用消毒过的剪刀剪去主根。将配置好的菌剂接种在幼苗根上，使幼苗根系与菌剂紧密结合，接种量为2×106个孢子/株，接种后放置于自然温室大棚中培养，用微喷保持基质湿润。

1.2.5 试验设计与调查

试验设计采用随机区组设计:每个小区10株，重复3次。接种后用每间隔1个月随机取5株，解剖镜LEICA S6D和显微镜OLYMPYS BX－5观察接种苗木的外延菌丝，记录其特征并照相，随机选取30个菌根测量菌根的长度和粗度。

1.2.6 菌根分子检测

采攀枝花块菌接种的云南松菌根20个左右，在体视菌下用毛刷刷掉泥土，清洗干净，用改进的CTAB法提取菌根的DNA，通过ITS序列的办法测定菌根上的真菌序列，ITS序列PCR扩增引物 ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC，ITS5:GGAAG TAA AAGTCGTAACAAGG)，扩增片段测序后与接种用的攀枝花块菌ITS序列比较[5]，以确定形成菌根菌的是否是攀枝花块菌。

2 结果与分析

2.1 菌根特征与菌根感染率检测

攀枝花块菌接种云南松树苗3个月可形成菌根。菌根检测时，先将云南松菌根苗根系用清水洗净表面的泥土，菌根结构肉眼便可观察到，云南松菌根菌根呈单轴状和二叉状分枝 (图3、图4)。菌根形成初期颜色为感染初期菌根尖淡乳色，基部淡黄色、黄褐色，菌根表面外延菌丝直立的着生在菌根表面，且不分支，较坚硬，半透明 (图3)，菌丝是从根系表皮细胞间隙向皮层伸展，并在皮层细胞之间交织成网状。可清晰看到菌丝在营养根表繁殖，层层交织形成的菌套(Mantle)呈暗褐色 (图5)，菌根横切面上能观察到哈蒂氏网 (Hartig net)结构 (图6)，菌根长到后期10个月左右，部分菌根就开始老化，变成褐色至黑色 (图7)。未接种苗(CK)未见任何菌根形成，仅见粗短的根毛，营养根不膨大，先端尖锐 (图8)。

攀枝花块菌接种云南松树无菌苗后，3个月左右开始感染形成菌根，随着培育时间的延长，菌根的数量也随之增加[4]，4个～6个月时，菌根的感染率达到90%～100%，经过测量，接种形成菌根后的平均根长4.66 mm，平均菌根粗1.40 mm(图4);未接种攀枝花块菌的云南松菌根平均长3.38 mm，平均粗0.98 mm(图8)，接种攀枝花块菌形成菌根后能明显促进根系的生长，地上部分的促生效果也比较明显 (图9)。

2.2 分子检测

PCR扩增显示，菌根提出的DNA能得到较单一的700 bp左右的条带，测序结果表明，与云南松形成菌根的真菌为攀枝花块菌。ITS序列同源性为100%，同时采用的是PCR产物直接测序，测序峰图清晰，无重叠峰，说明与云南松形成菌根的只有攀枝花块菌，没有其它菌根类真菌。

3 讨论

从接种菌根检测的结果可以看出，攀枝花块菌接种云南松宿主植物能形成很好的感染率，感染率在90%以上，所以可以得出云南松是比较好的宿主植物，用攀枝花块菌接种云南松形成菌根的技术是成功的。

本研究采用形态学和分子检测两种方法确定了攀枝花块菌与云南松能形成菌根，在中国白色块菌栽培上具有重要的应用意义。

攀枝花块菌是2010年首次在国内被发现，目前还没有人对它的自然分布、生长环境、宿主植物进行过系统调查，开展系统调查有助于攀枝花块菌的人工栽培。

[1]Jasmina Glamoelija，Radmila Vujieic，Jele－na Vukojevie.Evidence of trufles in Serbia [J].Mycotaxon，1997(65):211－222.

[2]陈应龙，弓明钦.块菌资源多样性及其地理分布[J].中国食用菌，2000，19(5):6－7.

[3]Xiao Juan Deng，Pei Gui Liu，Cheng Yi Liu.A new white truffle species，Tuber panzhihuanense from China [J].Mycol Progress，2013.12(3):557－561.

[4]苏开美，李树红，杨丽芬，等.印度块菌夏块菌与化香树合成菌根苗技术初探[J].中国食用菌，2012，31(3):10－12.

[5]柳成益，唐平，兰海，等.印度块菌菌根对苗木生长的影响[J].西南林学院学报，2008，28(6):21－24.