LAMP荧光染色法检测人乳头瘤病毒的临床应用

罗永富，龚宗跃

（湖南中医药高等专科学校，湖南 株洲 412012）

人乳头瘤病毒（Human Papilloma Virus，HPV）是引起尖锐湿疣的主要病原体，目前还不能进行体外细胞培养，且其抗原接触免疫系统的机会少，难以用检测抗体的方法诊断。PCR（聚合酶链式反应）检测病毒DNA序列具有特异和敏感等特点，但需要特殊的仪器设备，且对检测人员有较高的技术要求，难以用于基层。本研究采用环介导等温扩增技术（LAMP）结合荧光染色检测HPV，对尖锐湿疣的预防、早期快速诊断和治疗具有特别重要的临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床标本 所有临床标本均取自株洲市二医院皮肤科2011年5月至2012年8月期间的门诊患者，共76例。男性54例，其中20～30岁患者28例，30～40岁患者19例，40～50岁患者7例；女性患者22例，其中20～30岁患者15例，30～40岁患者6例，40～50岁患者1例。标本均由门诊医生采集，用棉拭子在患者外阴部疑似病灶部位涂抹，置于装有1mL无菌生理盐水的试管中送检。

1.1.2 试剂 针对HPV-6 E6基因（基因序号：AF092932）的174～381 bp序列和HPV-11 E6基因（基因序号：M14119）的129～306 bp区域序列，利用专用引物软件（Primer Explorer V4）分别设计两型HPV的4条LAMP引物，引物由广州英骏公司合成并分别配制成HPV-6引物液和HPV-11引物液；100 bp DNA Ladder（BioDev公司）；限制性内切酶（Pro mega公司）；Taq plus DNA聚合酶（北京鼎国公司）；Betaine（Fluka公司）；Bst DNA Polymerase（Biolabs公司）；DNA Maker I（天根公司）；dNTP（北京鼎国公司）；一管式病毒DNA提取试剂盒（四川天泽公司）；MgSO4（Sigama公司）；SYBR Green I（北京天恩泽基因科技有限公司）。其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 标本处理与核酸提取液制备 送检标本充分振荡悬浮，挤干棉拭子中的水分，弃棉拭子，15000 r/min离心5分钟，弃上清液，留沉淀，加600μL病毒DNA提取液充分混匀，加700μL异丙醇，振荡混匀，12000 r/min离心1分钟，弃上清液，沉淀用75%乙醇洗涤2次，12000 r/min离心1分钟，弃上清液，将离心管倒置于滤纸上10～15分钟，待酒精挥发完后加入100μLTE溶液，4℃过夜充分溶解DNA，-20℃保存备用。沙眼衣原体阳性标本同样处理，作为阴性对照备用。

1.2.2 LAMP取反应杯4只，1号和2号为待测杯，3号和4号为沙眼衣原体阳性标本核酸提取液的阴性对照杯。具体方法见表1。

表1 环介导等温扩增（LAMP）

混匀，置于65℃孵育扩增60分钟，然后置于80℃2分钟灭活酶，终止扩增。

1.2.3 染色与结果观察 每只反应杯中加入荧光染料SYBR Green I 1.0μL，混匀，置于紫外灯下观察结果。反应混合物变绿为阳性；保持SYBR Green I的橙色不变为阴性[1]。

实验数据采用SPSS13.0软件进行统计学分析。

2 结果

阴性对照标本为阴性。LAMP检测76例临床标本发现，23例为HPV-6阳性，18例为HPV-11阳性，合计41例阳性，总检出率为53.95%。PCR检测结果发现，25例为HPV-6阳性，15例为HPV-11阳性，合计40例阳性，总检出率为52.63%。在LAMP检测为阳性的标本中，有6例PCR检测为阴性，而PCR检测为阳性的标本中，有5例LAMP检测为阴性。各临床病例标本检测结果统计见表2。

表2 76例临床标本检测结果统计（例）

经方差分析：χ2=0，P>0.05，LAMP与PCR的检出率无显著性差异。

3 讨论

（1）环介导等温扩增技术[2]针对靶基因6个区域设计4条特异引物，利用链置换DNA聚合酶（Bst DNA Polymerase）在恒温条件下完成扩增，扩增效果可用凝胶电泳、比浊、染色等多种方法检测，具有反应时间短、肉眼可判断结果和不需要PCR仪等优点。众多学者尝试利用该技术对多种病原体进行检测的方法研究，取得了令人满意的结果[3-6]。本报导是在实验室基础研究的基础上进行的临床实际应用并与PCR方法比对的研究。

（2）人乳头瘤病毒6型和11型引起的传染性疾病是一个严重的公共卫生问题，也被认为是人类生殖器癌潜在的主要致病因素[7-10]。探索适应基层医疗单位特异、快速、敏感及简便的临床人乳头瘤病毒检测方法具有重要的社会价值和理论意义。本研究为LAMP的临床应用做了有益的探索。

（3）统计结果表明，LAMP与PCR的阳性检出率无显著性差异（χ2=0，P>0.05），说明LAMP完全可以替代PCR，可作为基层医疗单位临床实验室常规检测方法推广应用。

[1]Iwamoto T，Sonobe T，Hayashi K.Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of mycobacterium tuberculosis complex，intracellu lareinsputum samples[J].JClin Microbio，2003，41（6）：2616-2622.

[2]Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Res，2000，28（12）：63.

[3]张灏.检测猪肺炎支原体LAMP方法的建立与初步应用[D].武汉：华中农业大学，2012.

[4]范宏英，龙敏，刘欢，等.阪崎肠杆菌环介导等温扩增检测方法建立[J].中国公共卫生，2011，27（1）：31-33.

[5]燕勇，曹家穗，高雯洁，等.利用环介导等温核酸扩增技术（LAMP）快速检测霍乱弧菌[J].中国卫生检验杂志，2011，21（5）：1158-1162.

[6]李霞，张宏伟，郑文杰，等.耐甲氧西林葡萄球菌mecA基因的LAMP检测方法研究[J].食品研究与开发，2011，32（8）：68-71.

[7]Gissmanm L，Wolnik L，Ikenberg H，et al.Human papillomavirus types 6 and 11 DNA sequences in genital and laryngeal papillomas and in some cervical cancers[J].Medical Sciences，1983（80）：560-563.

[8]Watari，Hidemichi，Michimata，et al.High prevalence of multiple human papillomavirus infection in Japanese patientswith invasive uterine cervical cancer[J].Pathobiology，2011，78（4）：220-226.

[9]Chitladda Saetiew，Temduang Limpaiboon，Patcharee Jearanaikoon，et al.Rapid detection of the most common high-risk human papillomaviruses by loop-mediated isothermal amplification[J].Journal of virological methods，2011，178（1）：22-30.

[10]Le Luo，Kai Nie，Meng-Jie Yang，et a l.Visual detection of high-risk human papillomavirus genotypes 16，18，45，52 and 58 by loop-mediated isothermal amplification with hydroxynaphthol blue dye[J].Journal of clinicalmicrobiology，2011，49（10）：3545-3550.