一种基于二代测序技术的无创产前诊断方法

姚 琳

(上海交通大学生物工程专业 工程硕士班级Z1208021，上海200240)

1 传统检测方法回顾

以往对染色体非整倍体疾病的产前检测大多采用血清学筛查加胎儿染色体核型分析诊断的方法，前者的假阳性率较高，约有5%－10%的孕妇将被筛查为高风险，这些数量众多孕妇不得不接受后者的诊断，而胎儿染色体核型分析又需要进行羊水穿刺等，这类侵入式诊断方式意味着约1% 的流产率［1］，于是非侵入性的产前检测方式成为广大孕妇和医疗工作者共同的追求。同时，血清学筛查方法极高的假阴性率又使得为数众多的患儿出生，给病人、家属和社会带来负担，于是寻求一种准确率较高的筛查方法刻不容缓。

传统检测方法的准确率如图1 显示。

图1 唐氏综合征传统筛查方法的准确率

2 无创产前检测技术方法原理

无创产前检测( Noninvasive prenatal testing，NIPT) 是以孕妇外周血(5 mL) 作为检测样本，通过不加区分的对其中的总游离DNA 进行大规模平行测序，结合数学模型和数据分析，对胎儿染色体非整倍性疾病进行检测。该方法在唐氏综合征、13－三体综合征和18－三体综合征的产前检测方面，方法成熟，数据可靠。该方法可以在胎盘循环建立后的整个孕期进行检测［2］，本着早发现的原则，其最佳检测时间为孕早、中期，如在孕晚期通过超声等手段发现可疑病例，仍可使用该方法进行检测。

为了更好地解释其原理及数据分析依据，以21号染色体为例作如下假设:

如图2 所示，假设每毫升母体外周血中的染色体中有1 000 份21 号染色体基因组当量，母源性的染色体占900 份，胎源性的染色体占100 份。对于怀有正常胎儿的孕妇，胎源性的100 份中有200 份的单链片段可以通过比对定位于21 号染色体上，母源性的900 份中有1 800 份的单链片段可以通过比对定位于21 号染色体上，通过计数，共获得2 000份21 号染色体单链片段。而对于怀有唐氏综合征胎儿的孕妇，由于其来自胎儿的21 号染色体多出一条，则胎儿的100 份基因组当量中含有300 份的单链片段可以通过比对定位于21 号染色体上，母亲的900 份基因组当量中含有1 800 份的单链片段可以通过比对定位于21 号染色体上，两者相加，2 100 份的单链片段可以通过比对定位于21 号染色体上。即使考虑染色体片段化程度不同的偶发因素，在测序通量足够大的情况下，可以得到比较确定的结果，即怀有21－三体胎儿的单链片段数要大于怀有正常胎儿的单链片段数，从而对疾病进行检测。

图2 数据比较:21－三体胎儿与正常胎儿

3 无创产前诊断的具体操作

具体操作方法为，首先从离心孕妇外周血后获得的血浆中抽提DNA，收集总DNA 中符合一定长度的DNA，通常为100－200 bp，因为这个长度的总游离DNA 中，胎儿游离DNA 的含量高，有利于后续检测。然后使用T4 DNA 聚合酶( T4 DNA Polymerase)、克列诺片段( Klenow Fragment)、T4 多聚核苷酸激酶(T4 PNK)补平片段末端。在片段3’端加碱基A，根据碱基互补配对的原则，使其与带有T 碱基的接头(Adaptor)连接，该接头上还连有大规模平行测序所需的索引序列。使用PCR 对两端带有接头的DNA 片段进行扩增并使用磁珠法纯化PCR 产物。对得到的该长度的DNA 片段进行平行随机测序，通过对每条DNA 片段检测其前25个或36个碱基(由厂家提供的不同读长的测序试剂盒决定)，然后通过对这些确定了一段序列的特征DNA 片段与参考序列的比对，将这些片断归类到每条染色体。计算归类到每条染色体的片段数量占总片段数量的百分比。如果胎儿是21－三体，则21 号染色体的特征片段的量将有过度表达，也就是说归属于21 号染色体的特征DNA 片断的比例将有所升高，通过对这种微小的升高进行区分，根据统计学经验设定一个阈值(Z Score)，筛选出超过该阈值的样本，从而检测出患有相应染色体非整倍体疾病的胎儿。

4 无创产前诊断与传统诊断方法的特点对比

传统的唐氏筛查采用在孕早期超声检测胎儿NT 值联合母体血清中的PAPP－A［3］，在孕中期检查母体血清中的AFP、hCG、uE3( +Inhibin－A)，准确率(即敏感性)在64%－96%［4］，该方法一方面只能达到筛查出部分病例(即64%－96%) 的目的，另一方面，高于5%的孕妇会得到高危结果［5］( 即特异性约为95%)，按照染色体非整倍体疾病的发病率推算，这些得到高危结果的孕妇中约98%其实怀有健康胎儿，然而在得到高危结果后，孕妇需要通过有创的羊水穿刺或脐带穿刺等进行染色体核型分析来进行确诊(该技术的准确率约为100%)，从而决定胎儿的去留，而穿刺会有1%左右的流产率，从而成为很多孕妇顾忌之处。经过多年的研究，利用第二代测序技术检测母体外周血中的胎儿游离DNA 可以克服上述缺陷。于是当高通量深度测序技术走向成熟后该技术也得以从理论走向了临床现实［6］。

5 无创产前诊断技术的局限

由于无创产前检测技术可以对每条染色所占总染色体的比例进行精确定量，从而弥补了血清学筛查方法不能检测13－三体染色体数目异常的不足，并且该方法还能够对大部分性染色体的非整倍体情况进行检测。

尽管目前大多数相关机构只是对13、18 和21号染色体的检测情况出具报告［7］，但就其原理和数据分析的过程可以认为，理论上该技术对任何一条染色体的常规非整倍体检测都具有同样的高敏感性和特异性，只是因为目前所用的数学模型尚缺乏临床数据的支持和检验。

另外，目前该技术的难点还集中在三个方面:双胎和多胎妊娠的检测;性染色体非整倍体的检测;嵌合型、平衡异位型染色体非整倍体以及染色体微重复和微缺失的检测。对于双胎及多胎妊娠，以双胎妊娠为例，研究发现，其总DNA 中cffDNA 的含量大于相同孕周单胎妊娠的cffDNA 含量，但同时又小于其二倍，所以，该技术能够检出双胎及多胎妊娠胎儿染色体非整倍体是否存在，但无法具体到个体［8］，尽管如此，该方法依旧为决定后续是否需要进行胎儿染色体核型分析提供了一定的依据［9］。对于性染色非整倍体的检测，由于对母体和胎儿的游离DNA 不加区分随机测序，故对于XXY 三体型、XYY三体型的性染色体非整倍体必须结合孕周考虑，并增加测序的覆盖深度( coverage) 进行检测，目前尚存在一定难度，对于X 单体型、XXX 三体型的性染色体非整倍体，理论上具有和检测其他染色体同样的敏感性和特异性。对于嵌合型、平衡异位型染色体非整倍体以及染色体微重复和微缺失的检测，目前还不具备有效的方法和数据，这是该技术的局限性。

表1 筛查指标与存在问题

6 总结

经过多年的研究、实践和改进，这项基于母体外周血中游离胎儿DNA 片段测量的无创产前检测方法，在与高通量测序技术的结合下，逐渐走向成熟，并应用于临床。与传统的通过超声技术以及检测血清中各种激素的筛查技术相比，该技术具有经过多方论证的，显著提高的敏感性和特异性［11］。而与作为产前诊断金标准的染色体核型分析技术相比，该技术又以取样的无创性见长。随着二代测序成本的不断下降，该技术有望越来越广泛地应用于临床，目前推荐的流程是，首先通过该技术对几乎全部孕妇进行筛查［11］，其优越的敏感性可以筛出高于99%的病例，与此同时，其出色的特异性又使得只有不足1%的孕妇需要接受下一步的有创诊断［12］，极大地提高非整倍体疾病的检出率的同时降低了为诊断而造成的损失，具有杰出的社会价值。

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