甲状腺乳头状癌中HiWi基因mRNA和蛋白表达及其相关性

王 雅 赵 星 马从乾 杨 轲 (南阳市中心医院血管外科，河南 南阳 473000)

抑癌基因功能丧失和癌基因表达是细胞癌变的分子基础〔1，2〕。Hiwi基因为Piwi基因家族的一员，是小RNA复合体的基本组成成员之一〔3〕，当小RNA与具有同源序列的靶mRNA或靶DNA结合后，Hiwi家族蛋白诱导组蛋白或区域DNA甲基化，删除部分DNA序列、降解mRNA、抑制翻译活动从而发挥基因沉默作用，进而诱导肿瘤的发生〔4～6〕。研究发现，Hiwi基因在许多肿瘤中表达升高，而甲状腺乳头状癌(PTC)中Hiwi mRNA及蛋白的表达及其相关性，至今尚未见报道。本研究旨在探讨Hiwi mRNA及蛋白的表达与PTC发生、发展的相关性。

1 材料与方法

1.1 组织标本 50例PTC及其切缘与癌灶相隔2 cm的非癌上皮(NCE)组织，均经病理证实，分别取自2009年1月至2013年1月南阳市中心医院普外科手术切除标本。所有病例术前均未接受化疗、放疗及其他免疫治疗。50例患者中，男15例，女35例，年龄13～77岁，中位年龄45岁。TNM分期(按2002年国际抗癌联盟公布的标准进行)，Ⅰ期6例，Ⅱ期22例，Ⅲ期18例，Ⅳ期4例;病理分级Ⅰ级38例，Ⅱ级12例;淋巴结转移阳性32例，阴性18例。

1.2 组织总RNA及组织蛋白的提取 取80 mg组织及1 ml trizol放入EP管并置于超声组织破碎仪中，按照trizol说明书提取样本总RNA。紫外分光光度仪测定其吸光度，计算其浓度，并且在1%的琼脂糖电泳中检测其完整性。取80 mg组织及1 ml蛋白组织裂解液(RIPA)和10 μl蛋白酶抑制剂(PMSF)放入EP管并置于超声组织破碎仪中，之后按照RIPA裂解液说明书提取组织蛋白。二喹啉甲酸(BCA)法测蛋白浓度。

1.3 RT-PCR 取 A260/280 为 1.8 ～2.0 的 2 μg总 RNA 按照Prime ScriptTM 1 st Strand cDNA Synthesis Kit说明(大连宝生物公司)合成cDNA。用β-actin用内参照进行PCR扩增。引物设计为:Hiwi基因的引物序列:上游5'-AGAGGAACAGGAGGAAC-3'，下游5'-TCACATCCTCTCCATTCCGG-3'扩增长度 428 bp。β-actin的引物序列:上游5'-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3'，下游5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3'扩增长度230 bp。RTPCR 反应体系为 25 μl。TaKaRa Taq HS 0.25 μl;10×PCR Buffer 5 μl;dNTP Mixture 4 μl;Forward Primer 0.5 μl;Reverse Primer 0.5 μl;模板 2 μl;其余补水至 25 μl。循环参数:94℃ 5 min 预变性，94℃变性 1 min，50℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，30 个循环，72℃终延伸7 min。取PCR参物5 μl在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察并照相。使用Quantity-one软件计算各个样本Hiwi表达水平，表达量的相对值=待测基因扩增条带的灰度值/β-actin基因扩增条带的A值。

1.4 Western印迹取20 μg的组织总蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳80 V，待蛋白至分离胶后120 V。湿转220 mA，2 h将凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜上。5%的脱脂奶粉封闭1 h。加入1∶1 000的1×TBS稀释的一抗Hiwi(Santa Cruz公司山羊抗人多克隆抗体)，4℃过夜。1×Tris盐酸缓冲液(TBST)洗膜3次，10 min/次。加入1∶3 000的1×TBST稀释的二抗(北京康为世纪的兔抗山羊 lgG-HRP)，室温1 h。1×TBST洗膜3次，10 min/次。加入1∶1 000的1×TBST稀释的一抗(北京康为世纪的鼠抗人内参 β-actin一抗)，4℃过夜。1×TBST洗膜3次，10 min/次。加入1∶3 000的1×TBST稀释的二抗(北京康为世纪公司的山羊抗鼠 lgG-HRP)，室温1 h。1×TBST洗膜3次，10 min/次。待暗室加入电化学荧光法(ECL)发光剂曝光，显影。使用Quantity-one软件计算各个样本Hiwi蛋白表达水平。

1.5 统计学方法 应用SPSS17.0软件进行分析，数据采用s表示，对甲状腺乳头状癌和正常组织的mRNA和蛋白表达量进行配对t检验，对临床病理因素间的表达进行χ2检验。

2 结果

2.1 癌旁组织与PTC中Hiwi mRNA及蛋白的表达 在癌组织中均可检测到mRNA的表达，Hiwi mRNA在PTC组织中的表达量相对值(0.92±0.02)高于正常甲状腺组织(0.31±0.03)(P＜0.05)。在癌组织中均可检测到蛋白的表达，Hiwi蛋白在PTC组织中的积分光密度值(1 982.00±137.63)高于正常甲状腺组织中(982.01±125.32)(P＜0.05)。见图 1，图 2。

2.2 PTC中Hiwi mRNA及蛋白表达与临床病理特征的关系Hiwi mRNA的表达与患者的病理分级及淋巴结转移有关(P＜0.05);Hiwi蛋白表达与患者的TNM分期、病理分级及淋巴结转移有关(P＜0.05);两者均与患者的年龄、性别、肿瘤大小无关。见表1。

图1 Hiwi mRNA在PTC及其癌旁组织中的表达

2.3 Hiwi基因mRNA与蛋白表达的相关性 50例PTC中，Hiwi mRNA的表达大多伴随Hiwi蛋白的表达，两者具有相关性(P＜0.05)。其中Hiwi蛋白表达伴随RT-PCR表达8例，Hiwi表达伴随RT-PCR缺失18例，Hiwi蛋白缺失伴随RT-PCR表达19例，Hiwi蛋白缺失伴随RT-PCR缺失5例。

图2 Hiwi蛋白在PTC及其癌旁组织中的表达

表1 PTC组织Hiwi基因mRNA、蛋白表达阳性率与临床病理特征的关系〔n(%)〕

3 讨论

Hiwi基因位于12号染色体长臂〔3〕。Hiwi基因内含子为3.6 kb，编码相对分子质量为98.5 kD的蛋白，这个蛋白由861个氨基酸组成，与Piwi有52%的同源性，像其他Piwi基因家族成员一样也具有中部保守的结构域和C末端的Piwi box结构域。Hiwi是小RNA复合体的基本组成成员之一，当小RNA与具有同源序列的靶mRNA或靶DNA结合后，Hiwi家族蛋白则诱导组蛋白或区域DNA甲基化，以删除部分DNA序列、降解mRNA、抑制翻译活动从而发挥基因沉默作用，进而诱导肿瘤的发生。

目前有研究报道Runx3基因在肝癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌等肿瘤中表达〔7～10〕。但在PTC中Hiwi基因转录表达的影响国内外尚未见文献报道。从比较基因组学的研究观点，PTC的发生、发展很可能涉及到Hiwi基因的表达改变。

本研究结果表明Hiwi mRNA的表达参与了PTC的发生和发展。这与根据比较基因组学研究推测Hiwi可能在PTC中表达失活的结论相符。另外，本研究也提示Hiwi mRNA表达与PTC的恶性程度及预后有关，可能是一晚期事件。Western印迹结果更进一步说明，Hiwi蛋白的表达参与了PTC的发生与发展。

Hiwi基因在PTC中存在异常表达，在其发生和发展中起到一定的作用。Hiwi基因有可能成为PTC的生物学指标，检测Hiwi蛋白的表达有助于PTC的筛查、早期诊断和预后判断。

1 Tamura G.Alterations of tumor suppressor and tumor-related genes in the development and progression of gastric cancer〔J〕.World J Gastroenterol，2006;12(2):192-98.

2 Riley LB，Desai DC.The molecular basis of cancer and the development of targeted therapy〔J〕.Surg Clin North Am，2009;89(1):1-15.

3 Lin H，Spradling AC.A novel group of pumilio mutations affects the asymmetric division of germline stem cells in the Drosophila ovary〔J〕.Development，1997;124(12):2463-76.

4 Girard A，Sachidanandam R，Hannon GJ，et al.A germline-specific class of small RNAs binds mammalian Piwi proteins〔J〕.Nature，2006;442(7099):199-202.

5 Pal-Bhadra M，Bhadra U，Birchler JA.RNAi related mechanisms affect both transcriptional and posttranscriptional transgene silencing in Drosophila〔J〕.Mol Cell，2002;9(2):315-27.

6 Lee JH，Schutte D，Wulf G，et al.Stem-cell protein Piwil2 is widely expressed in tumors and inhibits apoptosis through activation of Stat3/Bcl-XL pathway〔J〕.Hum Mol Genet，2006;15(2):201-11.

7 He W，Wang Z，Wang Q，et al.Expression of HiWi in human esophageal squamous cell carcinoma is significantly associated with poorer prognosis〔J〕.BMC Cancer，2009;9:426.

8 Yang LJ，Chen Y，Ma Q，et al.Effect of betulinic acid on the regulation of Hiwi and cyclin B1 in human gastric adenocarcinoma AGS cells〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2010;31(1):66-72.

9 Jiang J，Zhang H，Tang Q，et al.Expression of HiWi in human hepatocellular carcinoma〔J〕.Cell Biochem Biophys，2011;61(1):53-8.

10 Zeng Y，Qu LK，Meng L，et al.HiWi expression profile in cancer cells and its prognostic value for patients with colorectal cancer〔J〕.Chin Med J(Engl)，2011;124(14):2144-9.