胰岛β细胞破坏的斑马鱼模型建立

夏 铭 潘 雪(贵阳中医学院，贵阳 贵州 550002)

糖尿病是以糖代谢紊乱为主要表现的内分泌疾病，源于糖的来源与去路失去了动态的平衡，导致胰腺功能障碍，胰岛素分泌减少。胰岛素由胰岛β细胞合成和分泌，经血循环到达体内各组织器官的靶细胞，与特异受体结合并引发细胞内物质代谢效应。关注胰岛β细胞的保护和再生作用的研究成为目前糖尿病防治工作的重点方向。

1 材料和方法

1.1 实验动物 构建生殖系稳定整合目的基因的转基因斑马鱼系F2代。进入北京爱生斑马鱼全自动养殖系统，按照Westerfield〔1〕方法喂养4 w后进行规律交配训练，以质量稳定的胚胎作为实验对象。

1.2 实验试剂 限制性内切酶、T4连接酶、E.coli DH5α感受态、凝胶纯化试剂盒、质粒小规模抽提试剂盒购自Takra公司;In Situ Cell Death Detection Kit、DIG标记试剂盒购自Roche公司;SP6 RNA polymerase、T7 RNA polymerase、T3 RNA polymerase、RNA柱纯化试剂盒购自Ambion公司;levamisol、甲硝唑购自Sigma公司。Western Blotting Chemiluminescence Luminol Reagent购自Santa Cruz公司。其他的常规生化及分子生物学试剂均购自上海生工生物工程公司。

1.3 主要实验仪器 斑马鱼养殖系统(北京ESEN Environ Science)、生化培养箱(青岛Hair)、梯度PCR仪和台式冷冻离心机(德国Eppendorf)、多功能电泳仪及水平电泳槽和UVP凝胶成像仪(上海复日科技)、杂交炉(美国Boekel)、蔡斯体视荧光显微镜及显微摄像系统(德国ZEISS Stereo Discovery.V20)。

1.4 全胚胎原位杂交(WISH)分别以构建好的斑马鱼胰岛素cDNA和GFP-PCS2+重组质粒作为模版，体外转录合成地高辛标记的反义mRNA探针;收集固定INS-nfsB-tg系F2代转基因斑马鱼胚胎，脱水后复水化处理，分别以胰岛素和绿色荧光蛋白(GFP)的mRNA探针于杂交缓冲液65℃杂交过夜。斑马鱼胚胎在封闭液中封闭1～3 h。然后加入抗地高辛抗体4℃处理过夜。之后用BCIP/NBT溶液处理胚胎30～60 min，显微镜下观察显色情况，然后用1 ml磷酸盐缓冲液(PBST)3次快速漂洗终止显色反应。当荧光蛋白与内源性胰岛素表达共定位，可证实绿色荧光蛋白对胰岛β细胞可靠的示踪性。

1.5 Western印迹技术 取20个斑马鱼胚胎于1.5 ml Eppendorf管中，去卵黄囊缓冲液(55 mmol/L NaCl，1.8 mmol/L KCl，1.25 mmol/L NaHCO3)，分离斑马鱼胚胎的卵黄囊，反复清洗2次后加入RIPA裂解液和PMSF超声裂解，酶标仪定量。取等量蛋白样品加等体积的上样缓冲液煮沸10 min，10%SDSPAGE电泳进行条带分离，SDS-PAG凝胶上的蛋白在 Mini Trans-Blot Cell(BioRad)中电转移到硝酸纤维素膜(OPTITRAN BA-S，Schleicher＆ Schuell，Keene，NH，USA)。封闭液 4℃封闭过夜，加入一抗，室温孵育1 h，PBST清洗后，加入二抗，室温孵育1 h，按试剂说明书用Western Blotting Chemiluminescence Luminol Reagent进行化学发光显影，并用X光片记录影像。为了检测活体荧光蛋白表达效率，通过Western印迹技术检测内源绿色蛋白的表达水平来测定甲硝唑破坏胰岛β细胞的效率。

1.6 免疫荧光 收集胚胎用4%多聚甲醛4℃固定过夜。胚胎进行脱水和复水，-20℃的甲醇过夜。-20℃预冷丙酮处理10 min，PBST清洗胚胎，TritonX-100室温透化30 min，阻滞液室温封闭1 h，加入特异性一抗4℃孵育过夜，PBST室温清洗3次后加入二抗，室温孵育1 h，去除二抗，PBST清洗降低背景，Tunnel反应液37℃孵育2 h，PBST清洗2次，荧光显微镜下观察结果。采用全胚胎免疫荧光的方法检测甲硝唑作用后绿色荧光蛋白表达效率明显降低。同时运用TUNEL试剂盒检测细胞凋亡情况。

2 结果

2.1 化学方法破坏胰岛β细胞 通过显微注射将转基因构件注入斑马鱼体内，筛选并获得可以稳定遗传的表达绿色荧光蛋白的胰岛β细胞的F2代转基因斑马鱼系(图1a)。运用INS探针和GFP探针，通过全胚胎原位杂交实验证实了绿色荧光蛋白与胰岛β细胞表型共定位(图1b)。Mt2孵育48 h后可见活体荧光蛋白表达量明显降低，同时胚胎发育情况和甲硝唑对胚胎的毒性没有明显影响(图1c)。

2.2 Western印迹技术证实胰岛β细胞的破坏效果 荧光显微镜下选取甲硝唑化学破坏48 h后的胚胎，绿色荧光蛋白表达明显减低的活体胚胎，荧光蛋白表达效率同时减低，且未在野生型组检测到荧光蛋白的表达。该结果证实了甲硝唑确实能靶向破坏胰岛β细胞，并能够通过活体荧光观察方便地识别(图2)。

2.3 全胚胎免疫荧光检测 甲硝唑组GFP荧光蛋白明显降低同时，细胞的凋亡也比对照组明显增多(图3)。

图1 化学方法破坏胰岛β细胞

图2 Western印迹技术检测荧光蛋白表达效率

图3 全胚胎免疫荧光检测绿色荧光蛋白表达

3 讨论

转基因技术为人类疾病动物模型研究提供了一种新的方法〔2〕，通过人为改造动物基因组，能在活体水平上研究人类疾病基本发生的分子机制、组织病理状况、治疗的效果等，目前应用于现代生物学的各个方面。

研究利用斑马鱼这一模式生物〔3〕，因其常年产卵，一次交配能获得数百个胚胎，胚胎在体外受精，发育早期呈透明，易于操作，发育过程可被直接连续观察，方便进行大规模的化学突变型筛选，定位克隆和活体候选药物筛选等诸多优势。前期研究中，通过显微注射的方法，将转基因构件整合至斑马鱼基因组中，构建了特异性标记胰岛β细胞为“绿色”细胞的胰岛β细胞转基因斑马鱼系。在转基因斑马鱼的胚胎养殖水中加入甲硝唑，通过硝基还原酶还原甲硝唑的硝基成一种细胞毒成分〔4〕，既不影响胚胎发育，也不会引起胚胎过度畸形和大量死亡，同时随着基因的表达，这种细胞毒性可以靶向性作用于细胞的DNA代谢过程，抑制细胞的脱氧核糖核酸的合成，干扰细胞的生长、繁殖，最终导致细胞死亡，获得一种化学遗传学破坏胰岛β细胞的活体斑马鱼疾病模型。

不同类型糖尿病的病因不尽相同，胰岛β细胞不同程度破坏的核心病机引起了广泛关注。更多研究集中在保护、再生和移植胰岛β细胞〔5，6〕，期望可以获得糖尿病治疗的有效方法。

1 Westerfield M.The zebrafish book:a guide for the laboratory use of Zebrafish(Danio rerio)〔M〕.Eugene:University of Oregon Press，1995:56-60.

2 Wadsworth JD，Asante EA，Collinge J.Contribution of transgenic models to understanding human prion disease〔J〕.Neuropathol Appl Neurobiol，2010;36(7):576-97.

3 Jorqens K，Hillebrands JL，Hammes HP，et al.Zebrafish:a model for understanding diabetic complications〔J〕.Exp Clin Endocrinol Diabetes，2012;120(4):186-7.

4 Pisharath H，Parsons MJ.Nitroreductase-mediated cell ablation in transgenic zebrafish embryos〔J〕.MethodsMol Biol，2009;546:133-43.

5 Stendahl JC，Kaufman DB，Stupp SI.Extracellular matrix in pancreatic islets:relevance to scaffold design and transplantation〔J〕.Cell Transplant，2009;18(1):1-12.

6 Cantarelli E，Citro A，Marzorati S，et al.Murine animal models for preclinical islet transplantation:no model fits all(research purposes)〔J〕.Islets，2013;5(2):79-86.