来氟米特联合贝那普利对糖尿病肾病大鼠肾组织TGF-β1和CTGF表达的影响

孟 宇 金海峰 郑海兰 姜玉姬 李锦姬 金 华 (延边大学附属医院肾内科，吉林 延吉 33000)

糖尿病(DM)肾病(DN)作为是DM最常见、最严重的微血管并发症之一，DN引起的终末期肾病发病率呈逐年上升的趋势。DN特征性的病理变化为肾小球肥大、肾小球基底膜增厚、细胞外基质(ECM)聚集、系膜区增宽，病变进展最后可导致肾小球硬化、肾小管间质纤维化。目前认为转化生长因子(TGF)-β1、结缔组织生长因子(CTGF)是DN肾小球硬化形成过程中的重要生长因子。大量研究已证实应用血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)主要通过阻断血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的生成，从而阻断肾素-血管紧张素系统(RAS)对于保护肾脏、缓解肾小球、肾小管炎症、减少早期DN患者蛋白尿，延缓小管间质纤维化和肾小球硬化有显著的疗效〔1〕;来氟米特(LEF)是一种新型的免疫抑制剂，近年临床研究表明，淋巴样增强因子具有抗炎、抗增殖作用，可以降低DN患者尿蛋白排泄量，保护肾脏、延缓肾功能进展，但具体机制尚不明确。两者联合应用可能更好地保护肾脏功能，延缓DN进展。本实验通过观察联合应用来氟米特及ACEI贝那普利对DN大鼠肾脏病理改变及TGF-β1和CTGF表达的影响，研究在DM早期联合应用免疫抑制剂来氟米特及ACEI贝那普利是否更能明显延缓DN的发生及发展过程。

1 材料和方法

1.1 药品与试剂 来氟米特(商品名为爱诺华)由苏州长征-欣凯制药有限公司提供，贝那普利(商品名为洛汀新)由北京诺华制药有限公司提供。链脲佐菌素(STZ)(美国Sigma公司)，兔抗大鼠TGF-β1和CTGF抗体、细胞免疫组化法(SABC)免疫组织化学试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2 动物分组与模型制备 取体重180～200 g的Wistar雄性大鼠(由延边大学医学部动物科提供)53只，按昼夜时程平衡饲料喂养，自由饮水、进食，经1 w喂养适应期后，测定血糖均正常。禁食12 h后，随机取5只大鼠作为正常对照组(NC，n=5);其余48只大鼠一次性腹腔注射STZ(65 mg/kg，溶于pH 4.5，0.1 mol/L枸橼酸钠缓冲液，冰浴新鲜配制)，NC 组注射等量的枸橼酸钠缓冲液。48 h后取大鼠尾尖血，测血糖值均≥16.7 mmol/L，DM模型成功。NC组血糖正常。将模型组大鼠随机分成对照组(DN组)、贝那普利组、来氟米特组，贝那普利+来氟米特组(联合用药组)，各12只。造模成功第2天起，贝那普利组每天给予贝那普利(10 mg·kg-1·d-1)灌胃，来氟米特组每天给予来氟米特(10 mg·kg-1·d-1)灌胃，联合用药组每天给予来氟米特(10 mg·kg-1·d-1)和贝那普利(10 mg·kg-1·d-1)灌胃，NC组与DN组每天给予等量蒸馏水灌胃。

1.3 标本收集及生化指标 在实验第4、8、12周末测体重;将大鼠置于清洁的代谢笼中，收集24 h尿，测量24 h尿蛋白排泄量(24 h UPE)、尿肌酐(Ucr);采用乙醚吸入麻醉后，用毛细玻璃管在大鼠眼眶后静脉采血1.5 ml左右，测血糖(Glu)、血肌酐(Scr)，计算内生肌酐清除率(Ccr)。由于Ccr受体表面积的影响，采用Ccr/体重(kg)加以校正。Ccr(ml·min-1·kg-1)=尿肌酐(μmol/L)×每分钟尿量(ml/min)/〔血肌酐(μmol/L)/体重(kg)〕

1.4 病理学检查 (1)在实验第12周末无水乙醚麻醉后切取大鼠双肾，剥离双肾被膜，生理盐水冲洗残余血迹，滤纸吸干，电子天平称量左肾重量，将双肾沿矢状面剖开，放入4%多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋，行过碘酸雪夫氏染色(PAS)、TGF-β1和CTGF免疫组化染色的光镜样品制备。(2)免疫组织化学染色(TGF-β1和CTGF):切片厚4 μm，以酒精梯度常规脱蜡至水;含3%H2O2的甲醇室温孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶;高压修复抗原;加入1∶100稀释的兔抗鼠单克隆抗体，置湿盒中4℃过夜;1∶100稀释生物素化羊抗兔IgG，37℃孵育25 min;二氨基联苯胺(DAB)显色:1 ml蒸馏水加入试剂盒中A、B、C试剂各1滴，混匀后加至切片，室温显色，镜下控制反应时间5～10 min;苏木素轻度复染细胞核，脱水、透明、中性树胶封片。光镜下观察肾组织细胞质内有棕褐色颗粒者为阳性。每批均设有阴性对照。采用双盲法在光镜下随机选择20个肾小球/片，计数肾小球的阳性细胞数及细胞总数，TGF-β1和CTGF在肾小球细胞中的标记值为阳性细胞数/细胞总数。

1.5 统计学方法 应用SPSS11.5软件进行LSD-t检验和单因素方差分析(One-way ANOVA)。

2 结果

2.1 不同时期各组大鼠空腹血糖(Glu)的比较 NC组在各时期Glu均维持在正常范围，DN模型组、贝那普利组、来氟米特组及联合用药组大鼠各时期均≥16.7 mmol/L，与NC组比较具有显著差异(P＜0.01);同期DN模型组、贝那普利组、来氟米特组及联合用药组大鼠血糖相比，无统计学差异(P＞0.05)。

2.2 不同时期各组大鼠体重的比较 在实验第4、8、12周末测空腹体重，与NC组比较，其余各组大鼠体重均明显降低(P＜0.01);8、12 w末贝那普利组、来氟米特组及联合用药组体重均高于DN模型组(P＜0.05)，其中联合用药组更为明显(P＜0.01);12 w末联合用药组体重高于单用贝那普利或来氟米特(P＜0.05)。见表1。

2.3 12 w末各组大鼠左肾重、肾重指数的比较 与NC组比较，其余各组大鼠左肾重、肾重指数均明显增加(P＜0.01);与DN组比较，贝那普利组、来氟米特组及联合用药组肾重指数均有所下降(P＜0.05)，其中联合用药组下降最为明显(P＜0.01)。见表2。

表1 不同时期各组大鼠体重的比较(s，g)

表1 不同时期各组大鼠体重的比较(s，g)

与 NC 组比较:1)P＜0.01;与 DN 模型组比较:2)P＜0.05，3)P＜0.01;与贝那普利组比较:4)P＜0.05;与来氟米特组比较:5)P＜0.05;表2、表3 同

293.42±16.26 351.12±29.06 399.12±9.54 DN 模型组 235.67±12.491) 253.84±13.331) 272.14±15.031)贝那普利组 249.83±12.691) 287.29±28.621)2) 311.16±29.061)3)来氟米特组 251.27±16.521) 289.26±21.571)2) 308.60±28.491)3)联合用药组 253.19±13.791) 291.08±18.171)3)325.11±28.981)2)4)5)NC组

表2 12 w末各组大鼠肾重、肾重指数比较(s)

表2 12 w末各组大鼠肾重、肾重指数比较(s)

组别 左肾重(g)肾重指数(×103)1.11±0.15 2.79±0.43 DN 模型组 1.50±0.971) 5.54±0.531)贝那普利组 1.48±0.141) 4.79±0.651)3)来氟米特组 1.46±0.091) 4.78±0.251)2)联合用药组 1.38±0.101) 4.26±0.401)3)4)5)NC组

2.4 不同时期各组大鼠24 h UPE比较 与同期NC组比较，DN模型组、贝那普利组、来氟米特组及联合用药组大鼠24 h UPE显著增加(P＜0.01);随着时间延长，24 h UPE逐渐增多，8 w末联合用药组较DN模型组减少(P＜0.05);12 w末与DN模型组比较，贝那普利组、来氟米特组及联合用药组24 h UPE均减少(P＜0.05);与单用贝那普利或来氟米特比较，联合用药组24 h UPE明显减少(P＜0.05)。见表3。

2.5 不同时期各组大鼠Ccr的比较 与同期NC组比较，DN模型组、贝那普利组、来氟米特组及联合用药组Ccr升高(P＜0.05)，随着时间的延长，同期各用药组较DN模型组降低，12 w末联合用药组较DN模型组显著降低(P＜0.05)。见表4。

2.6 肾组织中TGF-β1、CTGF表达的变化 见表5，图1，图2。TGF-β1和CTGF在正常组大鼠肾小球和肾间质内无或极少表达。与NC组比较，TGF-β1和CTGF在DN组大鼠肾小球上皮细胞、毛细血管襻、系膜区、肾小管上皮细胞及间质细胞均有强烈表达(P＜0.01)，各用药组大鼠肾小球系膜区亦有表达，但较DN组弱;联合用药组表达较贝那普利组和来氟米特组更减弱(P＜0.05)。

表3 不同时期各组大鼠24 h UPE比较(s，mg)

表3 不同时期各组大鼠24 h UPE比较(s，mg)

NC组11.13±5.12 10.45±2.29 9.98±1.46 DN 模型组 40.42±2.661) 49.52±4.221) 56.98±4.651)贝那普利组 36.05±7.011) 41.03±10.701) 46.53±7.971)3)来氟米特组 39.29±12.641) 43.36±9.911) 48.08±10.091)2)联合用药组 31.04±5.271) 34.78±5.131)2)41.83±4.501)2)4)5)

表4 不同时期各组大鼠Ccr水平比较(s，ml·min－1·kg－1)

表4 不同时期各组大鼠Ccr水平比较(s，ml·min－1·kg－1)

与 NC 组比较:1)P＜0.05;与 DN 模型组比较:2)P＜0.05

4.63±0.40 4.52±0.51 4.38±0.57 DN 模型组 6.53±0.671) 6.31±0.781) 6.08±0.491)贝那普利组 6.24±0.721) 6.05±0.621) 5.62±0.531)来氟米特组 6.30±0.691) 6.09±0.711) 5.68±0.491)联合用药组 6.27±0.621) 5.98±0.551) 5.49±0.391)2)4 w 8 w 12 w NC组组别

表5 各组大鼠肾小球TGF-β1、CTGF平均光密度值比较(s)

表5 各组大鼠肾小球TGF-β1、CTGF平均光密度值比较(s)

与 NC组比较:1)P＜0.01;与 DN 模型组比较，:2)P＜0.01;与贝那普利组比较:3)P＜0.05;与来氟米特组比较:4)P＜0.05

组别 TGF-β1(OD值)CTGF(OD值)0.016±0.003 0.014±0.005 DN 模型组 0.184±0.0251) 0.189±0.0231)贝那普利组 0.137±0.0171) 0.142±0.0201)来氟米特组 0.146±0.0191) 0.151±0.0231)联合用药组 0.070±0.0042)3)4) 0.080±0.0092)3)4)NC组

图1 肾组织中TGF-β1免疫组化表达的变化(×400)

图2 肾组织中CTGF免疫组化表达的变化(×400)

3 讨论

TGF-β1是目前公认的促肾脏纤维化作用最强的因子，对于DN发生肾小球硬化、肾间质纤维化起重要作用〔2〕。研究证实在DN早期TGF-β1水平就已经升高，TGF-β1通过以下途径参与DN的发生发展:①刺激肾小管上皮细胞、系膜细胞、成纤维细胞分泌(ECM)成分(如Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白、纤维连接蛋白、层黏连蛋白等);抑制基质金属蛋白酶(MMPs)合成，促进金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)和组织纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)合成，从而促进ECM合成，减少ECM降解，导致ECM在肾小球系膜区大量聚积〔3〕。②抑制肾小球系膜细胞、内皮细胞、上皮细胞以及近曲小管上皮细胞的增殖分化，即使细胞停滞在 G1期，导致肾脏体积变大。CTGF是20世纪90年代Zhang等〔4〕从人脐静脉内皮细胞培养液中分离得到的，它属于即刻早期反应基因(CCN)家族，是一种富含半胱氨酸、由349个氨基酸组成的细胞因子。CTGF广泛存在于多种组织器官，以肾脏的含量最高，肾小球系膜细胞、上皮细胞、肾间质成纤维细胞等均可分泌。CTGF作为介导TGF-β1促纤维化活性的下游调节因子，正常生理条件下呈低表达或无表达，某些病理条件下，CTGF则过度表达参与纤维化疾病的发生，例如肾纤维化、肺纤维化等。发生DN时，高血糖、晚期糖基化终末产物(AGEs)、血流动力学异常、AngⅡ合成增多以及TGF-β表达上调等因素均可诱导CTGF表达上调〔5〕。CTGF可直接诱导肾小球系膜细胞(MC)肥大，亦可通过TGF-β途径间接诱导MC周期素依赖激酶(CDK)抑制剂(CDKIs)合成，后者可阻止细胞周期由G1期进入S期即细胞周期停滞在G1期，从而发生细胞肥大，也是DN早期肾小球肥大的发生原因之一;CTGF还可以上调ECM成分(FN、Ⅰ型、Ⅳ型胶原蛋白)的表达，通过增加组织TIMP-1、TIMP-3的表达，而阻止ECM的降解，参与DN晚期肾小球硬化的形成〔6，7〕。TGF-β1 和 CTGF 与 DN 的发生、发展有着密切的联系，寻找有效药物阻断其合成表达或抑制其活性，可防治或延缓DN进展。

DN使AngⅡ合成增加，降解减少，它通过血流动力学和非血流动力学双重作用参与DN的发生发展。①血流动力学:选择性收缩肾小球出球小动脉，使肾小球囊内压增高，UPE。②非血流动力学:通过促进硫酸肝素糖蛋白转运，破坏基底膜电荷屏障，增加肾小球毛细血管通透性，导致尿蛋白增加;AngⅡ还可以直接诱导肾小球系膜细胞、内皮细胞、肾小管上皮细胞等分泌多种炎症因子，如 TGF-β、VEGF、TNF 等〔8〕。ACEI能抑制AngⅠ向AngⅡ转换，使AngⅡ合成减少，因而ACEI治疗DN具有肾脏保护的作用。本实验结果与上述理论相一致。

来氟米特是一种新型的、具有抗增殖活性的免疫抑制剂，目前已被广泛应用于治疗自身免疫性疾病和免疫介导性疾病，如系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、难治性肾病综合征、类风湿关节炎、IgA肾病以及器官移植术后出现排斥反应等，并取得良好的疗效。因来氟米特具有免疫抑制及抗增殖作用，且低毒性、耐受性好、半衰期长、价格便宜，应用领域不断扩大，临床上已经应用于治疗DN。付宇等〔9〕将来氟米特用于治疗表现为大量蛋白尿的DN患者，结果显示患者UPE明显减少。这说明来氟米特有减少尿蛋白、保护肾脏的作用，但具体机制途径尚不明确。本实验证实来氟米特可以下调肾组织TGF-β1和CTGF的表达，考虑这是其保护肾脏的途径之一。

本研究结果提示来氟米特和贝那普利可减轻DN大鼠肾小球高滤过、高灌注、高压力状态，从而减轻DN早期肾脏肥大，并可以通过减少尿蛋白而起到保护肾脏的作用，且联合用药效果更佳。另外TGF-β1、CTGF确实参与DN的肾损害，贝那普利和来氟米特可以通过减少TGF-β1、CTGF在DN肾组织的表达而有效地保护肾脏，并且联合用药效果更为明显。

1 Ferrari P.Prescribing angiotensin-converting enzyme inhibitors and angiotensin receptor blockers in chronic kidney disease〔J〕.Nephrology，2007;12(1):81-9.

2 Yevdokimova NY，Komisarenko SV.TGF betal is involved in high glucose induced accumulation of pericelluar chondroitin sulphate in human endothelial cells〔J〕.J Diabetes Complications，2004;18(5):300-8.

3 Chen S，Cruz M，Jim B，et al.Reversibility of established diabetic glomerulo pathy by anti-TGF-beta antibodies in db/db mice〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2003;300(1):16-22.

4 Zhang J，Li PH，Yang L，et al.Connective tissue growth factor mediates high glucose induced down-regulation of podocalyxin expression in mouse podocytes〔J〕.Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao，2011;31(5):839-43.

5 Zhou G，Li C，Cai L.Advanced glycation end-products induce connective tissue growth factor-mediated renal fibrosis predominantly through transforming growth factor beta-independent pathway〔J〕.Am J Pathol，2004;165(6):2033-43.

6 周月宏，王秋月.CTGF在糖尿病肾病发病机制中的作用及意义〔J〕.国际内分泌代谢杂志，2006;26(4):273-6.

7 Hishikawa K，Oemar BS，Nakaki T，et al.Static pressure regulates connective tissue growth factor expression in human mesangial cells〔J〕.J Biol Chem，2001;276(20):16797-803.

8 Leehey DJ，Singh AK，Alavi N，et al.Role of angiotensin Ⅱ in diabetic Nephropathy〔J〕.Kidney Int Suppl，2000;77:S93-8.

9 付 宇，王 丹，石 鹏，等.来氟米特治疗糖尿病肾病大量蛋白尿20 例临床分析〔J〕.临床内科杂志，2007;24(7):470-1.