他克莫司对IgA肾病模型大鼠肾脏的影响

刘宝玲 刘 冰 陈 志 孙珉丹 (一汽总医院肾内科，吉林 长春 300)

IgA肾病是以IgA沉积为主，伴或不伴IgG、IgM及C3沉积为特征的一类肾小球肾炎，是导致终末期肾脏病(ESRD)的最常见的原发性肾小球疾病之一〔1〕。他克莫司(普乐可复)是一种新型高效的免疫抑制剂，主要治疗器官移植后的抗排斥反应〔2〕以及自身免疫性疾病，有关其在肾病领域的研究主要集中在狼疮性肾炎〔3〕及早期膜性肾病。本实验探讨牛血清白蛋白(BSA)联合脂多糖(LPS)制备IgA肾病模型大鼠及普乐可复防治IgA肾病的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级6周龄雄性Wistar大鼠50只，体重(200±20)g，购自吉林大学白求恩医学院动物实验室。所有大鼠实验前尿红细胞计数及尿蛋白定性试验均呈阴性(尿沉渣计数法、试纸条法)，排除动物因素对实验结果的影响。

1.2 材料及主要仪器 BSA来自瑞典进口分装，LPS为美国Sigma公司产品，四氯化碳(CCl4)及蓖麻油购自天津化学试剂厂，普乐可复出自 Astellas Ireland Co.，Ltd.Killorglin，Co.Kerry，贝那普利由北京诺华制药有限公司惠赠。SP免疫组化试剂盒、AEC显色试剂盒及DAB显色试剂盒均由福州迈新生物技术有限公司生产。荧光显微镜购自OLYMPUS公司，型号BX51。

1.3 动物分组、IgA肾病模型的制备以及给药方法 大鼠随机分为正常对照组10只，造模组40只。正常对照组从实验开始第1天起给予4 ml/kg的蒸馏水隔日灌胃1次，共8 w;皮下注射0.9%氯化钠溶液0.4 ml/只，每周1次，持续9 w;于第6周经尾静脉注射0.9%NaCl 0.2 ml/只。第10周起，给予4 ml·kg-1·d-1蒸馏水灌胃，1次/d。IgA肾病模型制备根据陆慧渝等〔4〕方法及预实验结果，将BSA以蒸馏水配成100 g/L的浓度，从实验第1天开始以 BSA 400 mg/kg灌胃，隔日1次，共8 w;皮下注射 CCl40.1 ml+蓖麻油 0.3 ml，1 次/d，共 9 w;于第6周尾静脉注射LPS 0.05 mg/只。第9周随机选取造模组8只及正常对照组2只，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠取肾组织经苏木素伊红染色(HE)及免疫组化观察证实IgA肾病造模成功后随机分为4组，每组8只。自第9周起，正常对照组给予4 ml·kg-1·d-1蒸馏水灌胃，1次/d;模型组给予蒸馏水4 ml·kg-1·d-1灌胃，1次/d;贝那普利组给予贝那普利 10 mg·kg·d-1，每日灌胃1次;普乐可复组给予普乐可复4 mg·kg-1·d-1，每日灌胃1次。贝那普利+普乐可复组:以普乐可复4 mg·kg-1·d-1+贝那普利10 mg·kg-1·d-1，每日灌胃1次;以上各组均持续至12 w末，以10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠后，无菌操作下摘除左肾，切取部分肾组织，置于10%甲醛中固定做光镜检查及免疫组织化学检查。

1.4 常规HE染色 将留取的大鼠肾组织置于4%中性甲醛固定液中固定48 h，常规脱水，透明，包埋，将蜡块切成2～3 μm的切片，进行HE染色，主要观察肾组织内的细胞成分和形态特点。光镜下观察肾组织病理改变，摄片。

1.5 SP免疫组织化学方法检测IgA的定位和表达 石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，自来水冲洗，蒸馏水冲洗。磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，每次3 min。每张切片滴加3%过氧化氢溶液，室温下孵育10 min，PBS冲洗3次，每次3 min。滴加非免疫动物血清，室温下孵育10 min。滴加兔抗大鼠IgA抗体(1∶200)于组织切片上，4℃过夜，PBS冲洗3次，每次3 min。滴加生物素标记的第二抗体于组织切片上，室温下孵育10 min，PBS冲洗3次，每次3 min。滴加链霉素抗生物-过氧化物酶溶液于组织切片上，室温下孵育10 min，PBS冲洗3次，每次3 min。滴加AEC显色液(现用现配)于切片上，显微镜下观察至显色满意，自来水冲洗，苏木素复染，流水冲洗反蓝。水性封片剂封片，显微镜下观察摄影。

2 结果

2.1 光镜组织学改变 光镜下可见正常对照组肾小球系膜细胞及基质无增生，毛细血管襻开放良好，肾小球无萎缩，肾小管结构基本规则，未见间质增生及炎细胞浸润;模型组多数肾小球系膜细胞和系膜基质弥漫性中度增生，肾小球基底膜节段性增厚，肾小球内少量炎细胞浸润，偶见球囊粘连和节段硬化，毛细血管管壁增厚，管腔中度狭窄，肾小管间质有较多炎细胞浸润，部分肾小管扩张，灶状肾小管萎缩;贝那普利组、普乐可复组肾小球系膜细胞、系膜基质轻度弥漫增生，肾小球内偶见炎细胞浸润，毛细血管管腔轻度狭窄，肾小管间质可见少量炎细胞浸润，肾小管管腔部分开放尚好。贝那普利+普乐可复组肾小球毛细血管襻开放尚好，系膜细胞、系膜基质轻度弥漫增生，肾小球基底膜未见明显增厚，肾小球内未见炎细胞浸润，间质偶见炎细胞浸润，肾小管小灶状轻度萎缩，偶见管型(见图1)。

2.2 免疫组组织化学法测定IgA表达 显微镜下可见除正常对照组外，各组大鼠肾小球系膜区和毛细血管棕黄色颗粒状及团块状的沉积，提示IgA肾病造模成功;模型组可见肾小球系膜区及毛细血管襻棕黄色强阳性染色区，个别呈团块状;各治疗组肾小球系膜区内IgA棕黄色强度较模型组稍弱，以贝那普利组+普乐可复组强度最弱(见图2)。

图1 各组大鼠肾脏组织HE染色(×400)

图2 各组大鼠肾脏组织IgA沉积强度(×400)

3 讨论

Berger等〔5〕首先报道了 IgA肾病，随后国内外众多学者〔6〕通过对其发病机制、流行病学、病理与临床、治疗及预后等方面的深入研究，认为主要是IgA为主的免疫复合物，伴或不伴IgG、IgM及C3，在肾小球系膜细胞和基质沉积，激活多种细胞因子及促发免疫反应过程，从而导致肾小球硬化、肾小管间质纤维化，最终引起肾衰竭。因此，如何抑制系膜基质沉积是延缓IgA肾病进展、改善预后的关键所在，也是治疗的靶点之一。

普乐可复是一种新型高效的免疫抑制剂，已应用于临床多种器官移植，免疫抑制效果良好〔7，8〕，主要是通过抑制 T细胞活化以及Th辅助细胞依赖型B细胞增生及抑制细胞因子IL-1～4、9、10等及干扰素(IFN)-γ的生成及 IL-2R的表达，从而发挥免疫抑制效应〔9～11〕，其抑制混合淋巴细胞反应能力较环孢素A大10～100倍〔12〕。在分子水平，普乐可复与T细胞内特异性受体蛋白(胞质结合蛋白-FKBP12)结合，形成复合物(普乐可复-FKBP12)，竞争性抑制普乐可复与钙调素的结合，使钙调素介导的信号传递系统受到抑制，阻断IL-2转录及抑制T细胞活化，从而发挥免疫抑制作用〔13〕。

1 王海燕.肾脏病学〔M〕.第3版.北京:人民卫生出版社，2009:993.

2 Pirsch JD.FK506 Kidney Transplant study group.A comparison of tacrolimus(FK506)and cyclosporine for immunosuppression after cadaveric renal transplantation〔J〕.Transplantation，1997;15;63(7):977-83.

3 陈 强，刘志红，胡伟新，等.普乐可复治疗Ⅳ型狼疮性肾炎的前瞻性临床研究〔J〕.肾脏病与透析肾移植杂志，2002;11(4):301-6.

4 陆慧渝，张巧玲，蒋小云，等.IgA肾病大鼠模型的建立〔J〕，中国误诊学杂志，2011;11(6):1264-7.

5 Berger J，Hingais N.Intercapillary depsits of IgA-IgG〔J〕.J Urol Nephrol(Paris)，1968;74(9):694-5.

6 余英豪，郑智勇，姚丽清.肾穿刺活检病理诊断彩色图谱〔M〕.福建:福建科学技术出版社，2008:63-721.

7 Starzl TE，Todo S，Fung J，et al.FK506 for liver，kidney and pancreas transplantation〔J〕.Lancet，1989;2:1000-4.

8 Pirsch JD.FK506 kidney Transplant Study Group.A comparison of tacrolimus(FK506)and cyclosporine for immunosuppression after cadaveric renal transplantation〔J〕.Transplantation，1997;63(7):977-83.

9 Dumont FJ.FK506，an immunosuppressant targeting calcineurin function〔J〕.Curr Med Chem，2000;7(7):731-48.

10 Denys A，Allain F，Masy E，et al.Enhancing the effect of secreted cyclophilin B on immunosuppressive activity of cyclosporine〔J〕.Transplantation，1998;65(8):1076-84.

11 Unere NA，Stevenson P，Schafer A.Pharmacokinetics of tacrolimus:clinically relevant aspects〔J〕.Transplant Proc，1999;31(7A):21S-4.

12 Hutchinson IV.The mode of action of prograf(tacrolimus)and its significance for long term graft survival〔J〕.New Horizons Kidney Transpl，1997;12(1):22-6.

13 傅 鹏，于 光，许 静，等.来氟米特联合激素延缓进展型IgA肾病肾功能减退的临床研究〔J〕.临床内科杂志，2006;23(11):731-3.