猪α+γ共表达干扰素在不同家蚕品种中的表达

张玉玉，张金卫，易咏竹，李江涛，徐森华，冯世明，鱼南洋，钟伯雄，丁 农

（1.浙江大学 动物科学学院，浙江 杭州 310058； 2.湖州市农业科学研究院，浙江 湖州 313000；3.中国农科院蚕业研究所，江苏 镇江 212018）

我国的猪肉位居我国各种肉产品消费的首位，约占67%[1]，养猪业已成为推动农业经济发展的支柱产业。但随着生猪养殖的规模化和集约化，生猪重大疫病发生的风险在不断加大，猪瘟、高致病性猪繁殖与呼吸综合征、口蹄疫等重大疫病在部分养殖户和规模养殖场中有所发生。猪的各类传染病，尤其是病毒性疾病不仅严重危害着养猪业的发展，造成重大经济损失，还会危害人类的健康。因此病毒病的预防和治疗成为养殖业的重中之重，研制出高效经济的抗病毒和免疫增强药物成为解决问题的关键。

干扰素（Interferon，IFN）最早发现于1957年，Isaccs和Lindenmann利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感病毒的干扰现象时，发现被病毒感染的细胞所产生的一种因子[2]。干扰素是人和动物细胞受到特定干扰素诱生剂刺激后，由巨噬细胞、淋巴细胞等产生的一种具有多种生物学活性的糖蛋白。干扰素具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫增强等多种生物活性，具备无休药期、无药残、无毒副作用、不产生耐药性、可反复使用的优点，迄今为止一种最理想的抗病毒生物制剂。大量体内和体外试验表明，猪干扰素对生猪生产具有重大威胁的病毒均具有抑制作用。Chin⁃sangaram等报道猪IFN-α/β能抑制口蹄疫病毒在PK细胞上增殖[3]，后续又报道显示用腺病毒表达载体表达的猪α干扰素能完全使猪免受口蹄疫病毒的感染[4]。家蚕杆状病毒表达体系表达的外源蛋白几乎都是可溶性的，其免疫原性和生物活性非常接近天然来源的分离物，且家蚕具有可大规模饲养、安全性好、生长周期短等优点。猪干扰素α和干扰素γ在抗病毒活性方面具有协同增强作用，能够提高重组干扰素产物的效价及稳定性[5，6]。由此可见，利用家蚕生物反应器共表达生产含有猪α+γ的复合型干扰素，应用于猪病毒性疾病防治猪干扰素对生猪生产健康发展具有重要作用。

丰富的家蚕种质资源是品种改良和有效基因利用开发的物质基础[7，8]，因而家蚕品种的选育、筛选便成为利用家蚕生物反应器表达外源蛋白中必不可少的重要环节。本文采用猪α干扰素（IFN-α）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒，通过对猪α干扰素在不同家蚕品种中表达的检测，为筛选适合高效共表达猪α+γ的复合型干扰素的家蚕品种提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

IFN-α ELISA检测试剂盒由德国IBL公司生产（上海将来实业有限公司提供）；重组杆状病毒rBmN⁃PV（Bm-α+γ）由中国农科院蚕业研究所提供；24个家蚕原种、7对杂交种组合蚕蛹由湖州农业科学院饲养提供。

1.2 方法

1.2.1 重组病毒rBmNPV（Bm-α+γ）的接种

以常规方法饲养及蛹期保护的各品种6～7 d蛹龄蚕蛹为材料，将重组杆状病毒rBmNPV（Bm-α+γ）按105pfu/头接种蚕蛹，然后置于25℃下表达4.5 d，收集发病蚕蛹，-20℃冻存。

1.2.2 IFN-α表达量的检测

按雌雄1∶1的比例随机抽取20头蚕蛹，研钵彻底研磨，转移至离心管中，8000 rpm离心10 min，取中间层，参照试剂盒说明书进行表达量检测。

2 结果与分析

2.1 不同家蚕原种对IFN-α的表达

对24个家蚕原种进行ELISA检测，IFN-α表达结果见表1。由表1可见，所选的24个家蚕品种对猪IFN-α的表达能力差异很大，白玉品种对IFN-α表达最好，表达量可达867.12 ng/L，而表达水平最低的TQ78仅是660.87 ng/L。中系与中系品种之间、日系与日系品种之间的差异也很大，12个日系原种的表达量平均为822.63 ng/L，12个中系原种的表达量平均为759.85 ng/L，初步可以认为日系品种的表达量高于中系品种。

表1 不同家蚕原种对猪α干扰素基因的表达Table 1 The expression of IFN-α in different parental silkworm varieties

2.2 不同家蚕杂交组合对猪α干扰素基因的表达

以表1中不同表达量的原种，组配了7对14个正反交组合采用双抗夹心ELISA法进行IFN-α表达检测，由表2可知，日系×中系组合平均表达量明显高于中系×日系。但在IFN-α表达量上这些杂交组合并没有明显表现出杂种优势，原种与其相对应的杂交种之间似乎没有直观的相关关系，即表达量高的原种杂交组合不一定高，反之亦然。TL3东×98晨和98晨×TL3东、秋丰×白玉和白玉×秋丰这两对杂交品种的表达量较低，推测是由于该品种对该型重组病毒的抵抗力较强，表现为对外源基因的表达能力较低。

表2 不同家蚕杂交组合对猪α干扰素基因的表达Table 2 The expression of IFN-α in different hybrid silkworm varieties

值得一提的是中国系统与日本系统在蛹体重指标的杂交优势明显，一般来说，蛹体大，血淋巴多，表达产物就多。因此，应用家蚕作为生物反应器表达猪干扰素的研究和产品开发中，在组配筛选出杂交优势明显蛹体大的家蚕品种的同时兼顾表达效率的筛选，是重要的攻关方向。本实验中结合蛹体重量和品种表达量的比较，以春628B×华213C正反交表达效率较高，或者日×中组合的金玉×秋黄、紫气秋实×春花绿池、皓月×菁松也比较好，可作为表达猪干扰素表达的专用品种。

3 讨论

当前兽医临床上大多是用大肠杆菌表达的猪干扰素，其表达的产物是以包涵体的形式存在的，表达出的产物不具有生物学活性，无法直接应用，必须经变性复性过程，但复性后效果往往不理想。利用酵母表达的干扰素，不均一性出现频率高，对产物的纯化非常不利[9]。迄今为止，已用大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞、杆状病毒等表达系统表达过猪干扰素[10～15]，但从表达产物的抗病毒活性来看，真核生物表达的产物要好于原核表达。

家蚕杆状病毒表达系统是利用家蚕杆状病毒BmNPV作为表达载体，在家蚕细胞系或虫体中表达外源蛋白的真核表达系统，具有安全性高、表达量高、容量大等特点。据了解，家蚕是目前唯一能大规模人工饲养的经济昆虫，生物学背景清楚，因此利用家蚕来表达和生产猪干扰素具有明显的优势。本实验中由于猪IFN-α和猪IFN-γ是联合共表达的关系，因此以猪IFN-α表达量的检测结果可以间接证明IFN-α+γ的表达量结果，这与钟鲁龙的研究结果一致[16]。从本文试验结论可知，不同品种、品系的家蚕对猪IFN-α的表达有较大差异，筛选适合猪干扰素表达的家蚕品种对产业化应用具有重要的意义。

[1]李清宏.改革开放以来中国养猪生产回顾分析与展望[J].中国畜牧志.2007，（18）：42～46.

[2]侯文德.分子病毒学.北京：学苑出版社，1990.

[3]CHINSANGARAM J，PICCONE M E，GRUBMAN M J.Ability of foot-and-mouth disease virus to form plaques in cell culture is associated with suppression of alpha/be⁃ta interferon[J].J Virol，1999，73：9891～9898.

[4]CHINSANGARAM J，MORAES M P，KOSTER M，et al.Novel viral disease control strategy：adenovirus express⁃ing alpha interferon rapidly protects swine from foot-andmouth disease[J].J Virol，2003，77：1621～1625.

[5]王彦彬，孙向丽，魏战勇，等.猪干扰素α和γ在杆状病毒中共表达及对PRRSV抑制作用[J].中国农业科学2011，44（9）：1931～1938.

[6]张志芳，李轶女，李金祥，等.动物α干扰素和γ干扰素的表达方法：中国，2012101105336[P].2014-11-19.

[7]黄德辉，李圣，孙家羿，等.浅谈家蚕品种的引进及利用[J].中国蚕业，2005，26（2）：89～90.

[8]颜新培，姚德球.家蚕种质资源的开发和育种展望[J].广东蚕业，2007，41（2）：36～38.

[9]王洪海，高卜渝，陈佩丽，等.酵母表达基因工程产物不均一性分析及其对策[J].中国科学，1994，24（12）：1270～1274.

[10]赵伟鸽.猪α、γ干扰素的原核表达、纯化及抗病毒活性初步检测[M].上海交通大学，2010.

[11]郑鸣，边传周，王老七，等.猪干扰素α、β和γ的融合表达及活性[J].中国农业科学，2012：1840～1847.

[12]姚清侠.猪α干扰素、猪β干扰素与猪γ干扰素的抗病毒活性及其免疫佐剂的研究[M].华中农业大学，2007.

[13]周国栋.猪α干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其免疫佐剂功能研究[M].南京农业大学，2006.

[14]吕平.猪干扰素α、β、γ在293T细胞中的表达研究[M].华中农业大学，2008.

[15]王彦彬.猪干扰素a和γ在杆状病毒/昆虫细胞系统中表达及重组蛋白初步应用[M].河南农业大学，2008.

[16]钟鲁龙.猪干扰素α和γ在家蚕中的共表达[D].中国农业科学院，2013.